乙型肝炎病毒表面抗体化学发光定量检测方法的建立

王小明，刘 平

(1、萍乡市人民医院，江西 萍乡 337055；2、重庆医科大学，重庆 400014)

乙型肝炎由乙型肝炎病毒 (Hepatitis B Virus，HBV)引起的是世界性传染病，主要通过血液、血制品、性传播及母婴传播，是引起肝硬化和肝癌的常见病因。乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)是乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg刺激机体产生的特异性抗体，是机体对乙肝病毒产生免疫力的保护性抗体，在肝炎或注射疫苗后产生，是机体对乙肝病毒产生抵抗力的标志[1-3]。通过对血清或者血浆中HBsAb的检测，可用于监测乙肝疫苗的效果评估或是对乙肝患者病情转归的观察。现行的酶联免疫法(ELISA)在临床实验室广为使用，但存在不能定量的缺点，不能及时提醒HBsAb低滴度人群再次接受疫苗免疫。而放射免疫法(RIA)存大有效期短，操作繁琐，环境污染，线性范围窄等缺点。化学发光免疫测定(CLIA)是一种具有广阔发展前景的非放射标记微时定量测定技术[4-5]，国外已成功应用，2000年以来，国内一些生物公司也相继研发出了各种化学发光定量测定试剂盒，本研究旨在建立乙型肝炎病毒表面抗体 (HBsAb)化学发光定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 纯化HBsAg购自美国Fitzgerald 公司；ALP， NaIO4，NaBH4，乙二醇购自 Sigma 公司；Abbott AxSYM系统及配套试剂为美国雅培公司；HBsAb国家定量参考品 (0408-871)和PANEL(0408)购自中国药品生物制品检定所；96孔白色化学发光板购自NUNC公司；化学发光免疫分析仪器(BHP9504)购自北京源德生物工程有限公司；标本为空腹静脉采血4～5ml，分离血清，-20℃保存。

1.2 固相抗体制备 将纯化HBsAg单抗用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH 9.6缓冲液稀释至10mg/L的包被液，微孔板各孔加100μl，37℃包被2h，洗板3次，再以1%BSA 37℃封闭2h，板条密封后置-20℃冷冻保存。

1.3 HBsAg-ALP标记物的制备 10mg HBsAg用0.05mol/L碳酸缓冲液透析至pH9.6，10mg ALP用NaIO40.5mg于 2～8℃活化 1h，用 20μl乙二醇终止，以0.05mol/L碳酸缓冲液透析8h。将活化的ALP与透析后的HBsAg混匀，2～8℃反应2h。再加0.5mg硼氢化钠(NaBH4)还原。以0.05mol/L碳酸缓冲液透析24h，其中换液三次，加50%体积甘油于-20℃保存。

1.4 HBsAb定标品的制备 筛选多份HBsAb强阳性血清，混匀，离心及过滤，加入0.2%NaN3，以HBsAb国家定量参考品 (浓度分别为 160、106.7 71.1、47.4、31.6、21.1、14、9.4m IU/ml) 标定混合血清HBsAb含量，再以标定好的混合血清以新生牛血清配制成 2000、500、100、20、5、0 m IU/ml，按 1m l/管分装，-20℃保存。

1.5 发光底物液的配制 配制0.05mol/L的Tris-HCl(pH 9.6)，加入 0.002mol/L的 MgCl2，灭菌。 按 1:10比例加入增强剂Sapphire-II，再加入0.5mol/L金刚烷(AMPPD),2～8℃存放。

1.6 测定方法 采用双抗原夹心法，即在包被有HBsAg的96孔白色微孔板上，每孔依次加入20μl HBsAb定标品或待测血清，100μl以反应缓冲液1:1000稀释的HBsAg-ALP标记物，37℃孵育30min后，用洗涤液洗涤5次，拍干。加入100μl发光底物液后第10～20min内测定各孔的相对发光值(RLU)。

1.7 数据分析和统计处理 由仪器自带软件绘制HBsAb浓度—RLU的标准曲线，根据待测样品RLU值，由定量软件直接计算转换成其相应的HBsAb含量。

2 结果

2.1 灵敏度 平行测定10孔零值定标品，以零值定标品的RLU±2SD作为试剂的最低检测限，得出该试剂的灵敏度为2m IU/ml。

2.2 精密性 分别用HBsAb含量为高、低的质控品进行精密性测定，每个质控品测定10孔，结果批内变异分别为6.5%、4.7%、4.4%，批间变异分别8.9%、7.3%、9.1%，见表 1。

表1 批内批间精密性

2.3 准确性 用不同浓度的血清样品分别测试样的添加回收率和稀释回收率。结果添加回收率为92.3～107.6%之间，稀释回收率为 91.7～110.4%。

2.4 特异性 经检测20份中检所阴性参考品，结果全小于10m IU/ml。

2.5 稳定性 把定标品、HBsAg包被板、HBsAg-ALP标记物置于37℃破坏7d后，与4℃保存试剂比较，定标品系列的RLU平均下降到86.4%，灵敏度下降至3.45m IU/ml，其它无明显差别。

2.6 剂量反应曲线：5～2000m Iu/ml检测范围内，HBsAb浓度—RLU的标准曲线γ=0.994，见图1。

图1 HBsAb浓度—RLU剂量反应曲线

2.7 临床符合率： 收集Abbott AxSYM系统检测过的样本213份，再以新建立的HBsAb化学发光定量检测方法进行检测，经数据分析，其阴性符合率为98.1%，阳性符合率为82.6%。且两种检测方法所测数值具有显著相关性。相关方程为Y=1.0381X＋0.8751 Abbott(n=213)，相关系数 γ=0.941，P＜0.001，见图2。

图2 本方法与Abbott系统检测临床标本的相关性

3 讨论

目前，中国大多数医院测定乙型肝炎血清标记物均采用ELISA法。ELISA法检测HBsAb需要分离结合态的抗原(或抗体)与游离态的抗原(或抗体)，因此需要反复加样和洗版，引入的误差也就大，加上酶标板的孔间存在差异，方法的变异系数就更大[6]。而采用化学发光法检测HBsAb，本次实验结果显示批内批间变异系数均<10%。

另外，ELISA方法仅为定性或半定量检测，无法准确测定HBsAb量；而CLIA法作为定量检测的方法，其灵敏度高，从本次实验可知其检测HBsAb的灵敏度可达2m IU/ml。WHO推荐，当HBsAb浓度达到10m lU/ml以上时，才对机体具有保护作用。因而采用CLIA法满足了对于临床的指导作用。同时采用定量方法测定HBsAb，根据血清HBsAb含量可判断机体对HBV的免疫状态及乙肝疫苗的免疫效果，特别是评价全面免疫的接种效果有重要意义[7-9]。

因此，我们建立的化学发光HBsAb定量检测方法，从现有的分析指标结果来看灵敏度高、特异性强、检测范围宽、无放射性污染，并且操作简单、测定结果可靠，有着广阔的应用前景。

[1]Shepard CW,Simard EP,Finelli L,et al.Hepatitis B virus infection:epidemiology and vaccination[J].Epidemiol Rev,2006,28(5):112-125.

[2]Enomoto M,Tamori A,Nishiguchi S.Hepatitis B virus genotypes and response to antiviral therapy[J].Clin Lab,2006 52(1-2):43-47.

[3]Gish RG,Locarnini SA.Chronic hepatitis B:current testing strategies[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2006,4(6):666-676.

[4]Kricka LJ,Stanley PE.Bioluminesence and chemiluminescence Literature[J].JBiolumin Chemilumin,1989,3(8):159-166.

[5]Kricka LJ.Ultrasensitive Immunoassay Techniques[J].Clin Biochem,1993,26(4):325-331.

[6]Milich DR,Chen MK,Hughes JL,et al.The secreted hepatitis B preeore antigen can modulate the immune response to the nucleocapsid:a mechanism for persistence[J].J Immunol,1998,160(4):2013-2021.

[7]张运洪,秦 苏,何静波,等.ELISA结合MEIA测定低水平HBsAg[J].临床检测杂志,2002,20(2):103.

[8]陈 瑜,单谷忠.低水平血清乙肝病毒表面抗原测定及其临应床意思义[J].中华检验医学杂志,2001,24(1):39-41.

[9]罗开忠,杨 旭,苏先狮,等.时间分辨免疫荧光法检测乙型肝炎病毒标志物[J].中华肝脏病杂志,2003,11(9):569-569.