探讨ELISA法检测血清结核杆菌抗原对肺结核病的诊断价值

张周云，熊国亮

(江西省胸科医院检验科，江西 南昌 330006)

血清学诊断结核病人抗体已有许多报道，但大多情况不是敏感性不够就是特异性不强[1]。尽管应用免疫学技术检测结核病抗原已有20多年的历史，但相关检测报道较少。近年来由于单克隆抗体制备技术的提高，取得了高效价的特异性抗体对提高结核抗原检测的敏感性和特异性起着至关重要作用[2-3]。为了探讨检测血清中结核杆菌抗原对肺结核病的诊断价值，我们应用单克隆抗体，采用ELISA夹心法检测了139例临床已确诊的活动性肺结核患者血清中结核杆菌分泌蛋白desA抗原，现将结果评价报告如下。

材料与方法

1材料

1.1 标本来源 2010年2月～7月我院结核内科139例活动性肺结核病住院患者，其中男83例、女56例，平均年龄54.3岁；我院呼吸内科、肿瘤科64例非结核性肺部疾病 (27例肺炎、16例慢性支气管炎、21例肺癌)住院患者，其中男36例、女28例，平均年龄58.7岁。全部病例根椐临床表现、体征、X线、CT、细菌学、细胞学、生化指标、免疫学或抗结核治疗有效等进行了确诊。所有患者均抽取空腹血分离出血清，每个患者的血清分两部分，一部分当天检测，另一部分-20℃冰柜保存。29例健康对照血清来自江西省血液中心献血员。

1.1 .2试剂 为郑州安图绿科生物工程有限公司产品，批号：20090813。

2方法

2.1 (1)取出一定量的包被孔，编号。留空白1孔，2孔加入阴性对照100μl，2孔加入阳性对照 100μl，其余各孔加样品稀释液100μl，分别加入血清20μl。(2)在微量振荡器上振荡30s使孔内液体混合均匀。(3)置37℃下温育30min。(4)用洗板机洗板6次。(5)每孔分别加入酶结合物100μl，空白孔不加。(6)重复操作步骤(3)(4)。(7)每孔中加入底物、显色剂各 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光反应10min。(8)加终止液50μl/孔，振荡混匀，立即用酶标仪450nm/630nm双波长测定各孔的吸光值。

2.2 结果判定

2.2 .1结果有效性 阳性对照孔OD值应大于0.8，阴性对照孔OD值应小于0.1，否则实验无效。

2.2 .2 CUT OFF值计算 CUT OFF值=0.1+阴性对照孔平均OD值 (若阴性对照孔平均OD值小于0.05，按 0.05 计算)。

2.2 .3检测血清OD值≥CUTOFF值时，判为阳性，否则为阴性。

结 果

1方法学稳定性实验表明，新鲜血清与-20℃冰柜存放30d的血清的结核杆菌抗原检测结果无差别。

2 139 例活动性肺结核患者血清结核抗原检出的敏感性为84.1%(117/139)；64例非结核性肺部疾病组结核抗原阳性率7.81%(5/64)，特异性为92.19%，29例健康对照血清检测全为阴性结果。详见表1。

表1 二组病例及健康对照组结核抗原检测结果

3 139 例活动性肺结核患者痰涂片抗酸染色和痰结核杆菌培养结果与血清结核抗原检出的关系，详见表2。

表2 痰涂片和痰培养结果与血清结核抗原检测的关系

从表中显示，结核杆菌抗原测定阳性与痰涂片阳性一致率为92.73%，结核杆菌抗原阳性与痰培养一致率为93.24%。

讨 论

1检测结核病患者血清结核杆菌抗原可以作为结核杆菌存在的直接证据，也可以避免结核病患者因免疫应答低下导致的体液免疫检测或细胞免疫检测的“假阴性”结果。一段时间以来，因检测结核抗原用的结核抗体存在交叉反应，导致结核抗原检测的特异性和敏感性低下。近年来由于单克隆抗体制备技术的提高，取得了高效价的特异性抗体，使得临床上检测结核病患者的血清中结核杆菌抗原成为可能。本实验采用的单克隆抗体是利用基因工程方法在体外表达结核分枝杆菌的desA蛋白抗原制备而成[3]，利用该单克隆抗体采用ELISA双抗体夹心法检测了139例临床已确诊的活动性肺结核患者血清中结核抗原，结果表明：其敏感性为84.17%，特异性为92.19%。

2实验结果也表明，血清在-20℃条件下存放30d与新鲜血清的检测结果无差异，有利于标本少的实验室集中时间检测。

3表2 中显示，痰菌阳性患者与血清结核杆菌抗原检测阳性的一致性很高 (涂片阳性为92.73%，培养阳性为93.24%)。对菌阴患者血清结核杆菌抗原检测阳性为78.57%。

4 64 例非结核性肺部疾病患者血清中有5例阳性，查阅该5例病历都没有合并结核的情况，为假阳性，因此检测非结核性肺部疾病患者的假阳性率为7.81%。

综上所述，采用ELISA双抗体夹心法检测活动性肺结核患者血清结核抗原虽有一定的假阳性，但仍有可能成为结核病敏感性高、特异性强的新型诊断方法。检测血清中结核杆菌分泌蛋白dseA抗原对诊断肺结核病有较高的应用价值。

[1]刘金花,彭泽华.血清结核抗体与特异性CIC测定综合诊断肺结核病163例[J].江西医学检验,2006,24(5):441-442.

[2]唐宇龙.三种结核分枝杆菌分泌蛋白的抗体制备及其在抗原检测中的应用[J].中国传染病杂志,2007,25(10):597-600.

[3]顾 军.结核分枝杆菌分泌蛋白desA的单克隆抗体及其在结核病血清学诊断中的应用[P].中国专利,200710054376.0,2008.11.12.