慢性乙型肝炎患者外周血T、B淋巴细胞变化与其HBV-DNA的水平相关性探讨

郑源海，周艳贞，林元峰，周艺华

(福建医科大学附属漳州市医院检验科，福建 漳州363000)

乙型肝炎病毒(HBV)是一种非细胞毒性病毒，其所致的肝细胞损坏是由机体针对HBV特异性抗原的免疫反应所引起，HBV感染所致的不同临床结果与机体不同的免疫状态密切相关[1]。机体免疫功能及病毒逃逸免疫的能力决定了HBV感染发生，发展和转归[2]。本文采用直接免疫荧光法通过流式细胞仪检测HBV感染者外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+)、B 淋巴细胞 (CD19+)及采用FQ-PCR检测血清中HBV-DNA载量水平，来评价HBV感染后血清HBV-DNA水平与机体免疫功能变化的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 91例慢性乙肝病毒(HBV)感染者，男64例，女27例，年龄 17～75岁，平均年龄36.9岁，符合2000第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准。正常对照组31例，其中男21例，女10例，年龄22～70岁。平均年龄35.7岁，均为我院体检中心体检合格的健康人。

1.2 仪器和试剂 IMMUNO-TROLTMCells标准品、CD19-PE、 CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5荧光标记抗体及红细胞裂解液 (Opti Lyse○RC)购自法国Immunotech公司，流式细胞仪为Beckman-Coulter公司生产的Epics-XL型流式细胞仪，HBV核酸荧光定量PCR试剂盒为厦门安普利生物工程有限公司生产，PCR扩增仪为Amplly公司的GeneLight9800荧光定量核酸扩增仪。

1.3 标本收集 抽取静脉血6ml分三管，一管用EDTA-K2抗凝，用于流式细胞术检测；另两管为分离胶管，分离血清后用于HBV及HBV-DNA病毒检测。

1.4 检测方法 采用IMMUNO-TROLTMCells标准品进行校正。各取100μl抗凝血于流式专用试管中，分 别 加 入 20μl CD19-PE、CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5荧光标记抗体，室温闭光反应20min，加入500μl红细胞裂解液，溶解红细胞15min，加入500μl鞘液混匀，1000rpm/min 离心 5min，弃上清，再加入500μl鞘液，混匀后上机检测并记录荧光抗体染色阳性 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+及 CD19+百分率。HBV-DNA定量分析采用荧光定量PCR法，严格按照试剂说明书步骤进行，HBV-DNA检测单位IU/ml表示。

1.5 统计学分析 采用t检验，应用SPSS13.0数据统计软件分析实验结果，P＜0.05为明显差异，P＜0.01为显著差异。

2 结果 见表1。

3 讨论

CD3分子构成TCR/CD3复合体为T细胞的特异性表面分子。根据T细胞表面表达CD4+CD8+分子，又分为T辅助/诱导细胞亚群(CD3+CD4+)和T抑制细胞亚群(CD3+CD8+)。TH细胞可产生多种淋巴因子，在体液免疫和细胞免疫的调节中起关键作用，在病毒的免疫应答中发挥中心作用；同时，对病毒清除起重要作用[3]。CD8+T细胞激活和抑制严格依赖CD4+TH细胞，正常情况下，两者保持一定的比例，维持机体的细胞免疫功能。TCR/CD3复合体是CD3+T细胞与T细胞抗原受体的独特结构(TI)结合形成的，传递信息。所以T淋巴细胞状态直接反映细胞免疫状况。本文结果表明DNA低拷贝组、高拷贝组的CD3+T细胞百分率及CD3+CD4+T与对照组、DNA阴性组比较明显减低，表明感染者特异性T细胞作用有所加强，而T辅助/诱导细胞亚群(CD3+CD4+)细胞生成减少，使特异性抗体产生不足，不能清除游离的乙肝病毒,可造成病毒在体内持续存在。CD4+/CD8+比值可监测人体细胞免疫功能，反映机体免疫状态的重要指标，比值失衡可能造成免疫紊乱和一系列免疫病理改变。本实验结果表明，与正常对照组、DNA阴性组比较，低拷贝组、高拷贝组CD4+/CD8+比值显著差异 (P＜0.01)，与相关报道一致[4-5]。 动态观察该比值的变化趋势可以反映HBV-DNA体内复制情况。

表1 HBV感染者外周血T、B淋巴细胞与HBV-DNA载量水平分析

人体体液免疫是机体免疫应答的重要组成成分之一，在人体特异免疫功能中起着重要的作用，是致敏B淋巴细胞受抗原刺激后，即转化为浆细胞并产生能与相应抗原结合的抗体[6]。B淋巴细胞作为人体的主要体液免疫细胞，其细胞表面标志已被人们所认识，CD19+细胞代表B淋巴细胞水平。乙型肝炎病毒并不直接引起肝细胞的损伤，而是由于感染乙型肝炎病毒后引起人体细胞免疫和体液免疫应答造成的。本研究发现，慢性乙肝病毒(HBV)感染者的各组CD19+明显高于正常对照组(P＜0.05)。说明体液免疫在慢性肝炎的病程中起到关键作用，B淋巴细胞产生的抗体能对血液中的乙型肝炎病毒进行反应加以杀灭。

综上所述，通过对HBV感染者外周血T淋巴细胞亚群及B淋巴细胞检测，可及时提示HBV感染者免疫功能的变化并加强临床监测。

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[3李鸿宾,江晓萍,黄浏培,等.测定慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群的临床意义[J].安徽医药,2006,10(8):588-589.

[4]丁兆明.乙肝相关疾病HBV-DNA含量与细胞免疫功能相关性研究[J].医学检验与临床,2008,19(3):28-29.

[5]刘 明,沈 韻,陆 颖,等.慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T细胞亚群化与其血清HB-DNA的水平分析[J].中国实验诊断学,2008,12(2):232-235.

[6]杨绍基.传染病学[M].第7版,北京:人民出版社,1999:5.