时间依赖性荧光衰减对HLA-B27检测结果的影响

左 芳 ，程 晖 ，饶锦秀，翟中良，汪宏良

(1、湖北省黄石市中心医院医学检验科，湖北 黄石 435000；2、黄石理工学院医学院医学检验系 435000)

流式细胞术(Flow cytometry，FCM)是20世纪70年代发展起来的对单细胞定量分析的一种新技术，通过对流动液体中排成单列的细胞或颗粒进行逐个分析、测定细胞或颗粒的光散射和荧光情况，获取其大小、内部结构、DNA、RNA等理化特性。它借鉴了荧光技术、激光技术，单抗技术及计算机技术等多门学科和技术，有检验速度快、测量指标多、采集数据量大、对所需的细胞或颗粒可以进行分选等特点，广泛应用于基础研究和临床实践等各个方面[1]。批量标本检测时，随放置时间的延长，标本的荧光强度会发生一定的变化，我们对HLA-B27检测中荧光衰减与实验结果间的关系作了研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 按照1984年纽约修订的AS(Ankylosing spondylits，AS)诊断标准[2]，选择 2008 年6月～2010年6月本院门诊及住院AS患者56例，其中男性41例，女性15例，年龄18～41岁，平均年龄29.6岁。

1.2 实验仪器及试剂 EPICS-XL流式细胞仪由美国贝曼库尔特公司生产，标记物(HLA-B27-FITC/HLA-R7-PE)、阴性对照(IgG2a-FITC/IgG1-PE)、溶血剂 (Optilyse)、鞘液(Cell Sheath)、清洗液均由美国贝克曼公司提供。

1.3 实验方法 患者早晨空腹采取静脉血，EDTA-K2抗凝，混匀后待检。抗凝血100μl加入HLAB27-FITC/HLA-B7-PE 10μl后混匀，室温避光放置15min后加溶血剂500μl，室温避光放置20min。加鞘液500μl后2000r/min离心2min，弃上清液，混匀后再加鞘液500μl后2000r/min离心2min，弃上清，混匀加鞘液500μl，上机测定，每份样本检测均设阴性对照及荧光补偿。将56份阳性标本经过预处理后，立即上机检测，获取MFI值。此后，避光放置，分别 在 30min、1h、2h、4h、6h、8h 进 行 重 新 检 测 获 取MFI值。

1.4 检测与结果判断 计数HLA-B27阳性/HLAB27阴性细胞，同时记录其MFI值。若该群占总淋巴细胞百分比大于90%时，且其平均荧光强度大于8判为阳性。

1.5 统计学处理 实验数据以均数±标准差 (x±s)表示，各组间比较采用t检验。

2 结果

56 例阳性标本中，标本放置 30min、1h、2h、4h、6h、8h后检测后获取的MFI值，结果见表1。

3 讨论

表1 标本在放置不同时间后检测的结果比较(x±s)

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种侵犯骶髂关节、脊柱的慢性炎症性疾病，早期诊断、早期治疗具有重要的意义，而HLA-B27与AS的相关性则是迄今为止已知的HLA与疾病的关联中最强和最典型的[3]。有研究发现超过90%的AS患者其HLA-B27表达阳性，而AS由于其症状与许多其他疾病相似而难以确诊，因此HLA-B27的检测结果对该病的诊断有重要意义。

流式细胞仪检测HLA-B27主要是根据直接荧光染色及抗原与抗体特异性结合的原理，使鼠抗人的B27单克隆抗体与人淋巴细胞表面B27抗原结合。而HLA-B27属交叉反应群成员，是由分担共同表位的HLA抗原组成的。虽然鼠源的抗HLA-B27的特异性，仍然存在不同程度的交叉反应，而且主要是与HLA-B7的交叉反应，造成假阳性[4]。本实验中我们采用了双标记的荧光抗体，因此排除了HLAB7的交叉反应，从而减少了假阳性和假阴性的发生。

样品细胞的分离与固定、抗体标记、上机测试及数据分析是流式检验的一个连贯过程。因此，检测过程中的准确性与可靠性将直接影响检验结果，如：样本放置时间、样本的准备、固定的选择、实验对照的设立、免疫荧光标记的温度和时间及设门法对分析结果的影响等等。在实际工作中，我们发现MFI值随着样本暴露时间而存在着衰减问题，特别是对于大样本实验室，荧光随时间的衰减会造成对于阴阳性结果的判断误差。因此，应尽量将误差减少到最低，以得到稳定可靠的结果。每次实验必须进行光路、流路的校正及荧光补偿，使仪器达到最佳状态，每份标本都需做阴性对照，以提高结果的可靠性。

本研究显示，样本立即检测和 30min、1h、2h、4h后检测的MFI值检测之间无明显差异，而样本放置6h、8h后检测的MFT值与样本制备后立即检测的MFI值之间有显著性差异，具有统计学意义，这与文献[5]的报道结果基本一致。因此，制备好的样本最好在4h内检测，以提高准确性。

[1]郝彩霞,刘延香.流式细胞术在特发性血小板减少性紫瘫临床研究中的应用[S].安微医学,2009(30)2:208-209.

[2] Van Der Linden SJ, Valkenburg HA, Cats A. Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis: aproposal for modification of the New York criteria[J].Arthritis Rheum,1984,27(4):361-368.

[3]李 维.强直性脊柱炎与HLA-B27[J].国外医学.临床生物化学与检验学分册,2002,23(5):295.

[4]张 琰,温 浩,张朝霞,等.淋巴细胞HLA-B27抗原的表达及意义[J].新疆医科大学学报,2005,28(7):622-623.

[5]曹鲁宁,张珍珍,仲人前,等.流式细胞仪检测人白细胞抗原-B27的影响因素[J].检验医学,2007,22(3):233-234.