FTY720对大鼠急性脊髓损伤后RhoA表达的影响

王求永，刘文革，王振宇

基础研究

FTY720对大鼠急性脊髓损伤后RhoA表达的影响

王求永，刘文革，王振宇

目的观察大鼠急性脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后芬戈莫德（fingolimod，FTY720）对RhoA表达的影响，进一步探讨FTY720治疗SCI的可能机制。方法采用改良Allen’s法建立大鼠急性SCI模型。雌性SD大鼠75只，随机分为假手术组（n=15）、损伤组（n=30）和FTY720组（n=30）。FTY720组伤后30 min一次性腹腔注射FTY720 0.5 mg/kg，假手术组和损伤组以相同方法给予浓度为0.9%的生理盐水。分别于伤后1天、3天、7天、14天及21天，应用RT-PCR和Western印迹法分别检测RhoA mRNA和RhoA蛋白的表达。结果 损伤组RhoA mRNA和蛋白的表达于伤后3天开始明显增加，7天达到高峰，21天仍维持高水平表达；在同一时间点，与FTY720组和假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。FTY720组伤后1天、3天和7天的RhoA表达高于假手术组（P＜0.05）。假手术组各时间点RhoA表达维持在较恒定水平。结论大鼠急性SCI后RhoA表达增加，FTY720可能通过抑制SCI后RhoA的表达，以达到减轻继发性SCI、促进脊髓神经功能恢复的目的。

脊髓损伤；免疫抑制剂；FTY720；RhoA；大鼠

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种高致残性疾病。由于受伤机制的特殊性，对原发性SCI的干预措施相对较少，而针对继发性SCI，预防或减少神经元继发性凋亡和改善损伤局部的微环境成为当前研究的热点。20世纪80年代，Richardson等[1]发现，脊髓损伤后轴突很难再生，其主要原因并非由于轴突本身失去再生能力，而是因轴突周围环境中存在抑制分子所致。髓磷脂相关抑制物如Nogo-A、MAG、Omgp等[2]已被证实是SCI后早期轴突再生失败的主因，它们通过激活 RhoA及其下游的 Rho相关激酶（Rhoassociated kinase，ROCK）而最终导致生长锥的溃变，使神经轴突再生受到抑制。因此有效抑制RhoA的激活成为目前治疗SCI的一个新途径。Lee等[3]的实验研究表明，一种具有极强免疫抑制作用的神经鞘氨醇类似物——芬戈莫德（fingolimod，FTY720）可促进大鼠脊髓损伤后的功能恢复。本实验在大鼠急性SCI后早期腹腔注射FTY720，通过RT-PCR和Western印迹法检测SCI后FTY720对RhoA表达水平的影响，进而探讨FTY720可能的促进大鼠急性SCI修复的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

成年雌性SD大鼠[SCXK(沪)2007000512669] 75只，体重（200±10）g，由福建医科大学实验动物中心提供。主要试剂：FTY720（selleck，美国），Trizol试剂（Invitrogen），PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，日本），BCA法蛋白定量试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），RhoA及β-actin引物合成（上海生工生物公司），RhoA兔抗鼠多克隆一抗（Santa Cruz，美国）和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物公司)。

1.2 SCI模型的制作和分组

75只大鼠以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射，麻醉成功后将大鼠俯卧固定于动物手术台上，常规消毒后在无菌条件下，以T10为中心取背部正中切口，手术切除T9～T11椎板，暴露脊髓，改良Allen法（Weight dropping，WD）制模。SCI动物模型随机分为假手术组（A组）15只：只行椎板切除术，术后腹腔注射浓度为0.9%的生理盐水；损伤组（B组）30只：SCI后腹腔注射相同浓度的生理盐水；FTY720组（C组）30只：SCI后腹腔注射FTY720 0.5 mg/kg。术后每天早晚2次膀胱挤压排尿，直至建立反射性膀胱排空。

1.3 取材及切片制备

分别于术后1天、3天、7天、14天、21天切取大鼠脊髓组织，以损伤节段为中心约15 mm，由损伤正中处横断面用锋利刀片将其一分为二（分别用于行RT-PCR和Western blot法检测），立即置于液氮中，-80℃保存待测，每个时间点A组每次3只，B组和C组每次各6只。

1.4 RT-PCR法检测RhoAmRNA表达水平

Trizol试剂法提取大鼠脊髓组织总RNA，按PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作，以逆转录法先合成第一链cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。RhoA mRNA引物序列：正义链，5’-TAGAGTTGGCTTTATGGGA CAC-3’，反义链，5’-GCTTCACAAGATGAGGC ACC-3’；预扩增引物长度为428 bp；以β-actin作内参照，引物序列：正义链，5’-CACGATGGAGGG GCCGGACTCATC-3’，反义链，5’-TAAAGAC CTCTATGCCAACACAGT-3’；预扩增引物长度为240 bp。RT-PCR产物经1.3%琼脂糖凝胶电泳后进行凝胶成像系统分析处理，以RhoA与β-actin的灰度比值表示相对RhoAmRNA水平。

1.5 Western blot法检测RhoA蛋白表达水平

样品匀浆后采用BCA法测定总蛋白浓度。取80 μL样品和20 μL 5×样品处理液，混合均匀，沸水中煮沸10 min，然后上样，每孔上样量20 μL；电泳条件：5%浓缩胶恒压90 V，约20 min；10%分离胶恒压120 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。全湿式电转法将蛋白转移至NC膜上，将膜浸没在TBST溶解的5%脱脂奶粉中，37℃振荡封闭1 h，依次加入RhoA兔抗鼠多克隆一抗（1∶200）和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（1∶5 000）进行结合反应；ECL增强化学发光显色、压片、曝光、显影、冲洗胶片。以β-actin为内参照，求RhoA与β-actin的灰度比值表示相对RhoA蛋白水平。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 RhoAmRNA表达水平

见图1、表1。琼脂糖凝胶电泳目的基因产物符合设计大小，表明扩增产物是目的基因。A、B、C 3组在各时间点均有RhoA mRNA表达，与A、C组比较，B组RhoA mRNA表达水平于脊髓损伤1天后增高，3天后显著升高，1周时达高峰，2周时持续高表达，3周时略有下降，各时间点与A、C组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）；2、3周时A组与C组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 不同时间点各组RhoAmRNA表达变化

图2 不同时间点各组RhoA蛋白表达变化

表1 不同时间点各组RhoAmRNA的相对表达水平

表2 不同时间点各组RhoA蛋白的相对表达水平

2.2 RhoA蛋白表达水平

见图2、表2。A组RhoA蛋白表达水平随时间推移并无明显变化，而B组RhoA蛋白表达水平于术后3天明显增高，1周达高峰，2周、3周时仍有高表达，但较前有所下降；B组各时间点RhoA蛋白表达水平显著高于A组和C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；2、3周时A组与C组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

急性SCI包括原发性损伤和继发性损伤，SCI后轴突再生抑制是继发性损伤的重要组成部分，导致轴突难以再生的一个重要原因是损伤局部环境中存在一些轴突生长抑制因子，主要为髓磷脂相关抑制物如Nogo-A、MAG、Omgp等。这些因子虽然结构不同，但通过与相同的受体NgR共同介导，在p75的参与下，对细胞内RhoA信号通路产生影响[4-6]，最终导致生长锥的溃变，使轴突的生长受到抑制。Sung、吴滨奇等[7-8]的一系列实验研究表明，抑制RhoA信号通路对于促进SCI后轴突再生以及损伤后的功能恢复是一个可行的方法。

FTY720是近年来研究发现的将冬虫夏草抽提物中具有免疫抑制作用的成份ISP-Ⅰ进行结构改造而合成的一种新型免疫抑制剂[9]。与传统免疫抑制剂不同，FTY720的作用机制与淋巴细胞激活信号无关，而是以影响淋巴细胞定居和迁徙为主。S1P是鞘磷脂分解的一种产物，与其相结合的是5种G蛋白偶联受体，即S1P1～S1P5受体。这些受体在体内调节多种生理功能，其中S1P1受体在对淋巴细胞功能的调控方面起主要作用。FTY720在体内被鞘氨醇激酶2（Sph-ingosine kinase 2，SphK2）磷酸化为具有生物活性的(S)-FTY720-P异构体。(S)-FTY720-P与5种1-磷酸鞘氨醇受体中的S1P1、S1P4和S1P5受体之间具有高亲合力，与S1P3受体之间亲合力较低，与S1P2受体则不结合。磷酸化后的FTY720成为S1P的类似物，通过作用于S1P而抑制淋巴细胞外流，使S1P1受体下调，从而建立起一个暂时性的由药物引起的淋巴细胞S1P1受体缺失状态，进而限制淋巴细胞从胸腺和外周淋巴组织游出，导致外周淋巴细胞减少[10]。实验研究证实，FTY720作用于机体所造成的外周淋巴细胞减少是其免疫抑制的主要途径[11]。FTY720在器官移植的动物实验和临床Ⅲ期实验中均显示其强大的免疫抑制活性和独特的药理作用，且与常规免疫抑制剂有协同效应，毒副作用小[12]。近年来更有研究发现，FTY720对SCI具有明显的治疗作用。Lee等[3]利用FTY720治疗SCI的实验研究表明，FTY720能够明显减轻SCI部位炎症反应，并促进SCI后后肢功能和排尿功能的恢复。孙思鑫等[13]应用FTY720和他克莫司对大鼠SCI进行治疗的实验结果证实，SCI早期应用FTY720和FK506治疗均有显著疗效，两者相比又以FTY720效果更优；Zhang等[14]进一步研究发现，FTY720和FK506在大鼠SCI治疗中具有协同作用，其疗效比单用FTY720或FK506更明显。Miron等[15]的体外研究表明，FTY720通过调节S1P受体mRNA水平促进成人人体成熟少突胶质细胞的存活；实验观察结果显示，其对多发性硬化症和因髓鞘完整性受到破坏的SCI均有治疗作用。目前FTY720治疗SCI的作用机制尚不明确，研究者们推测在SCI动物模型中，FTY720可能通过诱导S1P1相关受体长时间内化而导致外周淋巴细胞减少，这就使得浸润到SCI部位的淋巴细胞明显减少，从而达到抑制损伤部位炎症反应、促进SCI修复的目的。

本实验通过RT-PCR和Western印迹法检测的结果发现，大鼠急性SCI后FTY720组RhoA表达在基因和蛋白水平较损伤组显著降低，推测FTY720可能通过抑制SCI后RhoA的表达来发挥作用。RhoA是小G蛋白超家族中Rho家族的Rho亚族中的成员。Rho蛋白以两种形式存在：GDP结合形式（GDP-Rho，非活化形式）和GTP结合形式（GTP-Rho，活化形式）。虽然RhoA作用有多个靶目标，但主要是ROCK（即Rho激酶），属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族成员，是RhoA下游最主要的也是最具特色的信号分子[16]。RhoA激活后，有活性的RhoGTP刺激下游的ROCK。RhoA与ROCK结合，取代ROCK的C末端自我抑制区，激活其催化区，使其活化，并进一步使肌球蛋白（myosin light chain，MLC）和MLC磷酸酶磷酸化，抑制MLC磷酸酶活性，使MLC活化，促进应力纤维形成，调节actin-myosin-Ⅱ的收缩力，从而影响肌动-球蛋白系统而导致生长锥塌陷。ROCK也可以通过作用于LIM激酶而发挥以上作用[17]。Zhou等[18]在体外研究中发现，FTY720可通过使RhoA-GTPase失活而抑制非雄激素依赖型前列腺癌细胞的侵袭能力。因此，FTY720有可能通过使RhoA-GTPase失活，抑制RhoA的激活，阻断RhoA信号通路的方式来促进SCI后的轴突再生，从而对损伤后功能的恢复起到促进作用。

综上所述，在脊髓损伤中，RhoA的活性表达可引起一系列反应，最终影响肌动-球蛋白系统而导致生长锥塌陷，神经轴突再生抑制。FTY720可能通过抑制大鼠脊髓损伤后RhoA的激活来改善损伤局部微环境，促进脊髓损伤神经再生和运动功能的恢复。FTY720是第一个S1P受体激动剂类新药，具有功能强大、作用可逆、给药方便、毒副作用小、治疗窗宽、不影响全身免疫功能等优点，且与环孢素A等传统免疫抑制剂具有协同效用，可望为治疗SCI提供新的途径。诚然，在临床应用之前，尚需大量实验对该药的适用性、有效性和安全性展开进一步的探索和研究。

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Effect of FTY720 on RhoA expression after acute spinal cord injury in rats

WANG Qiu-yong,LIU Wen-ge,WANG Zhen-yu.Department of Orthopaedics,Union Hospital Affiliated to Fujian Medical University,Fuzhou, Fujian 350001,China

LIU Wen-ge,E-mail:wenge1999@yahoo.com.cn

Objective To investigate the effect of fingolimod(FTY720)on RhoA expression after spinal cord injury(SCI)in rats,and explore the possible mechanism of FTY720 in the treament of SCI.Methods A rat model of acute SCI was established with a modified Allen's method.Seventy-five female Sprague-Dawley(SD) rats were divided randomly into three groups:the sham-operation group(n=15),the injury group(n=30)and the group treated with FTY720(n=30).The FTY720 group

intraperitoneal injections of FTY720 0.5 mg/kg at 30 minutes after SCI,and the sham-operation group and the injury group received 0.9%normal saline in the same way.The expression of RhoA mRNA and protein were detected respectively by RT-PCR and western blotting technique at 1 d,3 d,7 d,14 d and 21 d after SCI.Results The expression of RhoA mRNA and protein in the injury group rose markedly at 3 d,reached a peak at 7 d and still maintained high level at 21 d after injury.The results of the injury group compared to those of the FTY720 and sham-operation groups were statistically different at the same time point(P＜0.05).In addition,the expression of RhoA in the FTY720 group at 1 d,3 d and 7 d were higher than those in sham-operation group(P＜0.05)which kept a constant level throughout the experiment.Conclusion The expression of RhoA increases after acute SCI in rats.FTY720 may attenuate secondary SCI and improve the recovery of neurological function in rats by prohibiting the expression of RhoA after acute SCI.

Spinal cord injuries;Immunosuppressive agents;FTY720;RhoA;Rats

R651.21，R979.5

A

1674-666X(2010)04-0292-05

2010-10-30；

2010-11-28）

（本文编辑 陈 娜）

10.3969/j.issn.1674-666X.2010.04.010

350001福建医科大学附属协和医院骨科

刘文革，E-mail：wenge1999@yahoo.com.cn