IFN-γ上调MHC-Ⅱ分子表达对KC免疫原性的影响

宋仁刚 宋任强 柳大烈

IFN-γ上调MHC-Ⅱ分子表达对KC免疫原性的影响

宋仁刚 宋任强 柳大烈

目的观察在炎症因子IFN-γ的作用下，角质形成细胞（Keratinocyte，KC）免疫原性的变化情况。方法KC体外传代培养，按不同的INF-γ浓度分组后作用于传代的KC。将高表达MHC-Ⅱ分子的KC与异体淋巴细胞混合培养后，观察淋巴细胞的增殖情况；同时，将KC植入异体小鼠皮下，观察免疫排斥迹象。结果在6 000 U/mL IFN-γ的作用下，MHC-Ⅱ＋的KC超过90%。高表达MHC-Ⅱ分子的传代KC无明显刺激异体淋巴细胞增殖的作用，植入异体小鼠皮下后也无明显淋巴细胞浸润现象。结论传代后的KC在IFN-γ作用下高表达MHC-Ⅱ分子，表达MHC-Ⅱ分子的KC无明显免疫原性。

干扰素-γ主要组织相容性复合体-Ⅱ角质形成细胞免疫原性

组织工程化皮肤是目前治疗难治性溃疡、大面积烧伤等皮肤缺损性疾病最具前景的方法之一。但是，以异体皮肤细胞为种子细胞构建的组织工程化皮肤，移植后是否引起免疫排斥反应，却一直存在争议[1－3]。目前主要使用角质形成细胞（Keratinocyte，KC）、成纤维细胞等作为种子细胞来构建组织工程化皮肤。正常情况下KC表面仅表达MHC-Ⅰ类抗原，不表达MHC-Ⅱ类抗原及共刺激分子，本身不具备抗原递呈能力。但有实验显示，在炎症因子（如IFN-γ）的作用下，KC能诱导MHC-Ⅱ的表达。MHC-Ⅱ是专职抗原递呈细胞（Antigen presenting cell，APC）呈递抗原的重要结构之一[4]。因此，KC能否成为APC，从而激活T细胞需要实验证明。本实验模拟体内炎症状态下，用IFN-γ作用KC，观察MHC-Ⅱ分子表达情况，随即将表达MHC-Ⅱ分子的KC与异体淋巴细胞混合培养，观察淋巴细胞的增殖程度，并将表达MHC-Ⅱ分子的KC植入异体小鼠皮下组织，观察是否发生免疫排斥现象。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性6～8周龄BALB/c小鼠30只，体重20～25 g，随机平均分为3组。取皮组：小鼠背部常规消毒后，手术刀取约1 cm×1 cm的全层皮肤组织，培养表皮细胞；实验组：将培养的含有1×105个KC的培养基0.5 mL注入小鼠腹部皮下组织；对照组：将单纯培养基0.5 mL注入小鼠腹部皮下组织。

1.2 细胞培养

小鼠KC：小鼠皮肤标本加入0.25%Dispase（Sigma公司）浸没，消化16～18 h，眼科镊揭下表皮，加0.25%胰蛋白酶消化30 min，用吸管小心反复吹打，200目筛网过滤，离心后用含10%胎牛血清的DMEM培养基（Gibco公司）重悬，按1×106cells/mL密度接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中。当细胞约80%融合后，加0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA混合消化液消化后传代，细胞培养至第2代用于实验。

小鼠脾淋巴细胞：对照组小鼠处死后取脾脏，反复剪碎后，200目筛网过滤，小鼠淋巴细胞分离液分离（天津TBD公司），培养2 h后取悬浮细胞即淋巴细胞RPMI 1640培养基（Gibco公司）继续培养。

1.3 IFN-γ诱导MHC-Ⅱ分子的表达

配制含1×106U/mL IFN-γ（Sigma公司）的DMED培养基。以1×106cells/mL浓度接种第2代对数生长期KC于24孔板中，培养6 h后给药，各孔药物终浓度分别为1 000 U/mL、2 000 U/mL、4 000 U/mL、6 000 U/mL、8 000 U/mL、10 000 U/mL，设不含IFN-γ的培养基为阴性对照，继续培养48 h。部分细胞采用爬片法培养，拟行细胞免疫组化染色，方法如下：4%多聚甲醛/PBS固定，0.1%Triton X-100处理5 min，3%H2O25 min，正常山羊血清室温封闭10 min，加大鼠抗小鼠MHC-Ⅱ（I-A/I-E）单抗（天津三箭公司）4℃过夜，生物素标记山羊抗大鼠二抗(二抗试剂盒购自北京中杉公司)37℃孵育10 min，辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液37℃孵育10 min，DAB显色5 min，冲洗后封片，显微镜下观察。

1.4 流式细胞仪检测MHC－Ⅱ分子的表达

第2代KC经IFN-γ处理后，100 μL PBS重悬1×105个细胞，加FITC-抗小鼠MHC－Ⅱ（I-A/I-E）抗体，同型对照管中加入FITC-大鼠IgG2b（eBioscience公司），4℃放置30 min，PBS 2 000 r/min洗涤，重悬于0.4 mL PBS中，流式细胞仪（Beckman公司）分析。

1.5 混合淋巴细胞反应

分别将原代和第2代KC以1×102个、1×103个、1×104个细胞加入96孔板中，经8 000U/mL IFNγ培养48 h后，加入含25 μg/mL丝裂霉素C的DMEM培养基，继续培养细胞45 min，吸出培养基后各孔分别加入1×105个淋巴细胞，继续培养3 d。其余步骤按BrdU-ELISA试剂盒（Roch）说明书进行，即：各孔加10 μL BrdU孵育2 h；离心后加入200 μL固定液，室温下30 min；甩干固定液后加100 μL anti-BrdU-POD工作液，室温孵育90 min；反复冲洗3遍后加100 μL底物液，室温下10 min；分光光度计在370 nm波长处测量吸光度。设5 μg/ mL PHA处理的第2代KC为阳性对照，不经IFNγ处理的第2代KC为阴性对照，RPMI 1640培养基为空白对照。

1.6 小鼠体内观察淋巴细胞浸润

腹部皮下植入KC 2周后，处死实验组、对照组小鼠。取小鼠注入细胞处皮肤全层组织，中性福尔马林固定，行HE染色：石蜡切片常规脱蜡，苏木素染色，盐酸乙醇分色，淡氨水蓝化，伊红染色，系列乙醇脱水，入二甲苯，中性树胶封片；免疫组化：石蜡切片脱蜡，其余步骤同前述。

1.7 统计学处理

实验结果采用SPSS 11.0软件进行分析，各组数据均以均数±标准差（x±s）表示，各组间两两比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 培养细胞的生长情况

刚分离的小鼠KC呈圆形，活力较好，活细胞数均超过80%。2 h后细胞开始贴壁生长。细胞逐渐连接成片，似铺路石样生长。一个小鼠脾脏能分离约1×107个淋巴细胞。分离的小鼠脾脏淋巴细胞镜下观察为圆形，呈悬浮生长。细胞活力好，活细胞数均超过90%。

2.2 流式细胞仪分析

随着INF-γ浓度的增高，KC的MHC-Ⅱ表达逐渐增高（图1）。IFN-γ为1 000 U/mL时MHC-Ⅱ表达即明显增高；IFN-γ为6 000～10 000 U/mL时，MHC-Ⅱ达到峰值（IFN-γ在6 000 U/mL、8 000 U/mL和10 000 U/mL时无显著差异，P＞0.05）（图2）。

图1 小鼠KC MHC-Ⅱ在IFN-γ处理后的表达

图2 MHC-Ⅱ的表达趋势

2.3 淋巴细胞增殖实验

在不同KC刺激下，增殖的淋巴细胞吸光度不同。原代KC刺激淋巴细胞增殖非常显著（与阴性对照组比较，P＜0.05；与阳性对照组比较，P＞0.05)，且淋巴细胞增殖程度随刺激细胞数量增多而增高。第2代KC无明显刺激淋巴细胞增殖效应（与阴性对照组比较，P＞0.05；与阳性对照组比较，P＜0.05）（图3）。

图3 异体淋巴细胞增殖吸光度

2.4 组织学及免疫组化检测

免疫组化染色显示第2代KC的MHC-Ⅱ分子表达于细胞膜（图4）。经不同浓度的IFN-γ处理后KC均明显表达MHC-Ⅱ分子，且随IFN-γ浓度增高，MHC-Ⅱ分子表达加强。

图4 KC在IFN-γ的作用下表达MHC-Ⅱ分子（IH，400×）

植入小鼠KC 2周后，HE染色清晰可见小鼠皮下隆起的KC团块（图5），与周围组织区别明显。原代KC团周围及其细胞间可见较多单个核细胞浸润，第2代KC团未见单个核细胞浸润；原代KC团浸润的细胞免疫组化染色显示CD3、CD4阳性，CD8未见阳性染色（图6）；第2代KC免疫组化染色未见CD3、CD4和CD8阳性细胞。

图5 植入小鼠皮下的异体KC(HE，100×)

图6 植入小鼠皮下的异体KC中含有浸润的CD3＋细胞（IH，100×）

3 讨论

大面积烧伤、慢性皮肤溃疡等皮肤缺损性疾病一直是临床治疗的难题。组织工程基本原理是将体外培养的细胞与生物材料结合，移植到病损部位，种植的细胞增殖分化形成具有功能的活性组织。商品化的组织工程皮肤产品均采用异体细胞进行构建，但异体细胞经体外培养，与细胞外基质共同构建组织工程皮肤后，是否引起免疫排斥，一直存在争议。

KC是皮肤的重要的结构和功能细胞，正常情况下其表面仅表达MHC-Ⅰ类抗原，不表达MHC-Ⅱ类抗原及共刺激分子，本身不具备抗原递呈能力。但在体外培养条件下，KC经纯化结核菌素刺激后，能表达MHC-Ⅱ分子。某些异常情况下，如银屑病皮损、尖锐湿疣皮损中，KC高表达MHC-Ⅱ分子，并且与疾病活动密切相关[5]。另外，IFN-γ也能诱导KC表达MHC-Ⅱ分子。IFN-γ主要由活化T细胞产生，在抗原、PHA或ConA刺激下，T细胞分泌IFN-γ，通常与IL-2的产生相一致。IFN-γ能诱导单核细胞、树突状细胞、血管内皮细胞等表达MHCⅡ类抗原，使其参与抗原递呈和特异性免疫的识别过程。实验中加入IFN-γ后，KC均表达MHC-Ⅱ分子，表达的MHC-Ⅱ分子位于细胞膜。随着IFN-γ的浓度增高，MHC-Ⅱ分子的表达量也逐渐增高。当IFN-γ为6 000 U/mL时，MHC-Ⅱ分子的表达量达到峰值，超过90%的细胞表达MHC-Ⅱ分子。

MHC-Ⅱ分子抗原，是抗原递呈细胞和单核细胞表面糖基化的跨膜蛋白，表达MHC-Ⅱ分子对于向CD4 T细胞递呈肽段，启动特异性免疫反应非常必要。因此，有观点认为MHC-Ⅱ（+）的KC有可能成为非专职的APC，直接激活T细胞或可摄取和降解抗原向T细胞呈递抗原[6]。我们将不同比例的KC与小鼠脾脏淋巴细胞混合培养后发现：原代KC和PHA能明显刺激淋巴细胞増殖。经过IFN-γ处理后，第2代KC在不同比例下均未能有效刺激淋巴细胞増殖。原代KC能刺激淋巴细胞增殖，可能与其中混杂的细胞有关。表皮中除KC外，还有朗格汉斯细胞（Langerhans cells，LC）、黑色素细胞等多种细胞。LC是表皮中专职APC，表达MHC-Ⅱ抗原及共刺激分子。有实验证明皮肤中刺激异源性T细胞反应并启动移植物排斥反应的是LC。同种异体皮肤移植物是否被排斥与移植物内的LC密度相关，密度越高，越易被排斥，清除供体皮肤的LC将延长同种异体移植物的存活时间[7]。KC经传代后去除混杂细胞尤其是LC，是降低其免疫原性的主要原因。经IFN-γ处理的第2代KC高表达MHC-Ⅱ，但未能明显刺激淋巴细胞增殖，提示表达MHC-Ⅱ并不是KC刺激淋巴细胞增殖的前提条件。同样，有研究者认为在某些特殊的炎症条件下，KC高表达MHC-Ⅱ分子可能是炎症后的继发反应，而不是KC作为APC向T细胞递呈抗原的标志[8]。KC表达MHC-Ⅱ可能更利于其在炎症情况下易于分泌前炎症细胞因子，从而参与炎症反应[9]。

T细胞活化必须有双信号介导：第一信号是指T细胞表面受体与APC上MHC-抗原肽间的相互识别；第二信号是来自APC上的共刺激分子，其中CD80、CD86是目前研究最多的两个共刺激分子[10]。我们的实验中，流式细胞仪未检测到第2代KC表达CD80、CD86，虽然有实验显示小鼠表皮干细胞表达CD80[1]，但KC在分化过程中是否表达共刺激分子，目前仍无定论。有研究表明，KC能向幼稚CD4 T细胞递呈抗原，但因缺乏共刺激分子，递呈的抗原可能导致T细胞的失活而不是激活。通过转基因技术可以使小鼠KC表达CD80，同时给予IFN-γ，KC表达MHC-Ⅱ分子。表达CD80和MHC-Ⅱ的KC虽然能刺激异体T细胞增殖反应，但反应明显弱于专职APC（如单核细胞、树突状细胞）引起的刺激反应，提示非专职APC即使表达共刺激因子还不足以触发免疫反应，仅能扩大宿主的免疫反应[11]。

异体皮肤细胞移植后的转归目前还存在争论。有学者认为，异体表皮细胞移植后，最终将被宿主的免疫系统逐渐排斥，取而代之的是自体细胞。另有学者认为，移植的异体细胞能够长期存活。在实验中我们将原代KC、经过IFN-γ处理和不经过IFN-γ处理的第2代KC植入异体小鼠皮下。不同时间活检发现：随着时间延长，原代KC周围单个核细胞逐渐增多，免疫组化染色显示浸润的细胞CD3阳性，提示浸润的细胞主要以T淋巴细胞为主。相反，无论是否经过IFN-γ处理，第2代KC周围均未见明显的单个核细胞浸润，免疫组化染色未见CD3染色阳性细胞。上述结果提示：原代KC引起淋巴细胞浸润的原因可能与混杂的免疫原性较强细胞有关；KC仅表达MHC-Ⅱ分子还不足以趋化淋巴细胞浸润。深入研究组织工程化皮肤Apligraf移植后的临床表现，发现Apligraf不含LC、真皮树突状细胞、内皮细胞或淋巴细胞等抗原递呈细胞，临床试验显示移植Apligraf类似于移植自体皮肤，可以很好地愈合伤口并且迅速在其内部生成血管，其形态、生化及代谢特征与人体皮肤相仿，几乎无免疫原性，也未发生免疫排斥反应[12]。Phillips等[13]在研究Apligraf治疗下肢静脉溃疡的安全性和免疫学影响时也证实了上述观点，研究中没有发现明显的免疫排斥征象，也未检测出对KC异体抗原产生应答。Guerret等[14]将Apligraf移植于裸鼠，1年后用免疫组化的方法发现了存活的异体KC，上述证据进一步支持移植异体KC不存在排斥反应或排斥反应较弱。

综上所述，异体KC经体外传代培养后，去除了免疫原性较强的细胞。KC本身免疫原性较弱，不表达共刺激分子，虽然在炎症因子IFN-γ的作用下能表达MHC-Ⅱ分子，但仍无刺激异体淋巴细胞增殖的能力。体内实验也进一步证实，传代后的KC免疫原性较低，不是趋化淋巴细胞浸润的主要原因。本实验初步证明了传代后的KC免疫原性较低，为组织工程化皮肤的临床应用提供了实验支持。但体内免疫反应非常复杂，多种因素参与其中，包括各种细胞间的相互作用、细胞与基质间的作用以及多种炎症因子和细胞因子的作用，都不同程度地影响着免疫应答反应的发生、发展和结局。移植的异体细胞最终转归如何，仍需更长期的实验观察。

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The Effect of IFN-γ Increasing MHC-ⅡExpressing to the Immunogenicity of Keratinocytes

SONG Rengang1, SONG Renqiang2,LIU Dalie3.
1 Department of Plastic Surgery,Shenzhen People′s Hospital,Shenzhen 518020,China;2 Jiamusi Municipal Center for Disease Control and Prevention,Jiamusi 154002,China;3 Department of Plastic Surgery, Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510282,China.Corresponding author:LIU Dalie.

ObjectiveTo observe changes of immunogenicity of keratinocytes(KC)under the influence of interferon-γ (IFN-γ).MethodsKC were cultured and passaged in vitro.Different dose of IFN-γ stimulated KC to express MHC-Ⅱmolecules.KC with highty expressed MHC-Ⅱmolecules were mixed with allogenic lymphocytes to observe their proliferation.Simultaneously,MHC-Ⅱ+KC were implanted subcutaneously into allogenic mice to observe the sign of immunological rejection.ResultsUnder the influence of 6 000 U/mL IFN-γ,the percentage of MHC-Ⅱ＋KC exceeded 90%.MHC-Ⅱmolecules highly expressed KC had no effects to stimulate proliferation of allogenic lymphocytes significantly. There were no obvious lymphocytes infiltration when MHC-Ⅱmolecules highly expressed KC were implanted subcutaneously into allogenic mice.ConclusionPassaged KC could express MHC-Ⅱmolecules highty in the influence of IFN-γ,KC expressed MHC-Ⅱmolecules has no obvious immunogenicity.

IFN-γ;MHC-Ⅱ;Keratinocyte;Immunogenicity

R392.12

A

1673－0364（2010）05－0248－05

2010年7月21日，

2010年8月18日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.05.003

国家自然科学基金（30570517）。

518020广东省深圳市深圳市人民医院（宋仁刚）；154002黑龙江省佳木斯市佳木斯市疾病控制中心（宋任强）；510282广东省广州市南方医科大学珠江医院整形科（柳大烈）。

柳大烈