双醛普鲁兰改性胶原支架材料的制备与表征①

冯玉杰 卢伟 岩小丽 樊渝江

(四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心 四川 成都 610064)

双醛普鲁兰改性胶原支架材料的制备与表征①

冯玉杰 卢伟 岩小丽 樊渝江

(四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心 四川 成都 610064)

用高碘酸钠对普鲁兰进行氧化,制备一系列双醛普鲁兰,与胶原混合凝胶,冷冻干燥制备胶原/普鲁兰多孔复合支架材料。双醛普鲁兰的醛基和胶原的氨基反应形成希夫碱化学交联,交联度随着双醛含量的增加而提高,其降解速率低于纯胶原支架材料,且随双醛含量的增加而减小。细胞毒性毒性试验显示复合支架材料具有良好的生物相容性。表明这种复合支架材料是一种有前景的组织工程支架材料。

双醛普鲁兰 胶原 支架材料 降解 组织工程

胶原是人及脊椎动物体内含量最多的蛋白质,有良好的生物相容性及生物可降解性,同时具有低抗原性,可为细胞吸附和增殖提供必要的生物环境,已成为生物医学领域中应用最广泛的材料之一[1]。但做为植入材料,胶原有一个缺点:在体内胶原降解速度太快[2]。适当的交联反应能提高胶原的生物稳定性,降低其降解速率[3]。通过交联处理,胶原将具备更优良的性能,在组织工程支架材料上得到更广泛的应用。普鲁兰是无色、无味的天然高分子多糖,具有易溶于水、粘度较低、无毒副作用等特点,作为生物医学材料已经有很多应用实例[4]。用高碘酸钠将普鲁兰多糖氧化形成醛基[5],在低温(4℃)下可与胶原均匀混合,与胶原的氨基形成化学交联[6],升温到37℃可形成水凝胶,经冷冻干燥可得到天然多糖胶原复合支架材料。利用双醛普鲁兰多糖对胶原进行交联,可弥补胶原的降解速度过快的缺点,又可避免引入如戊二醛等有细胞毒性的交联剂,形成具有良好生物相容性的新型复合支架材料,可望在组织工程和再生医疗领域应用于细胞的三维培养和组织构建。

1 实验部分

1.1 双醛普鲁兰的制备

普鲁兰用纯水溶解,配制成100mg/mL的水溶液,加入一定量高碘酸钠(0.5mol/L)溶液后,用稀硫酸(0.2mol/L)调节反应体系pH至3.5,于25℃遮光反应6h,然后将反应液透析冻干,得到双醛普鲁兰。通过改变高碘酸钠的加入量,制备一系列不同氧化度的双醛普鲁兰。用FTIR对其结构进行表征,用碱消耗法测定双醛普鲁兰的醛基含量。

1.2 双醛普鲁兰-胶原复合支架材料的制备及表征

将pH=3.0的酸性胶原溶液(0.9w/w%)用1M NaOH溶液调节至中性(胶原终浓度=0.6w/w%)后,与不同氧化度的双醛普鲁兰溶液(2w/w%)以胶原/双醛普鲁兰=1/0.8的质量比于4℃搅拌混匀,静置24h,升温至37℃放置15min形成凝胶,用去离子水洗净PBS盐后冷冻干燥,制得多孔复合支架材料。

复合支架材料的交联度由TNBS法测定。将支架材料称重放入试管,TNBS溶液及热反应,使支架材料中未反应的胶原自由氨基与TNBS反应形成可溶性复合物。6M HCl在60℃下消化支架材料使其溶解,经稀释后测定345nm的吸光度。测定3个平行样取平均值。交联度(%)=(1-交联凝胶的吸光度/未交联水凝胶的吸光度)×100%,吸水率由复合支架材料浸水前后的质量计算。吸水率=(Wt-W0)/Wt×100%,降解率由支架材料浸泡在PBS(PH=7.2637℃)中随时间延长,其重量的减少计算。降解率=(W0-Wt)/W0×100%。

1.3 复合水凝胶形貌观察

将复合支架材料用刀片纵切为厚度1mm的薄片,用导电胶固定于扫描电子显微镜样品台上,用离子喷射仪(E-1010,HITACHI,JAPAN)表面镀金后,用扫描电子显微镜(S-4800,HITACHI,JAPAN)观察材料的形貌和孔径分布情况。

图1 不同醛基含量双醛普鲁兰制备的复合支架材料的SEM图像Figure1 Cross section SEM images of complex scaffolds derived from dialdehyde pullulan with different aldehyde content.

图2 复合支架材料的重量损失率从上至下分别为：纯胶原支架，醛基含量20%，40%，60%，80%的双醛普鲁兰/胶原复合支架材料Figure2 Weight loss of complex scaffolds.From top to bottom:Collagen scaffold,complex scaffold containing dialdehyde pullulan with 20%,40%,60%,80% aldehyde content, respectively.

图3 L929细胞24h和48h培养MTT评价Figure3 MTT assay of L929 cells after 24 and 48h culture

1.4 细胞相容性评价

将纯胶原支架材料和双醛普鲁兰/胶原复合支架材料(双醛普鲁兰氧化度80%,60%,40%,20%)用75%酒精灭菌并用PBS反复清洗后,用无血清培养基在37℃浸提24h,得到材料浸提液。在96孔板中每孔加入5000个L929细胞,培养24h使细胞黏附良好后,吸去培养液,加入材料浸提液进行培养。培养24h和48h后,用MTT法测定细胞活性。以培养基作为阴性对照。

2 结果和讨论

2.1 双醛普鲁兰多糖的制备

高碘酸钠特异的将普鲁兰多糖的邻双羟基氧化成醛基。一分子双羟基消耗一分子高碘酸钠。通过改变高碘酸钠与普鲁兰的比例可得到不同氧化度的双醛普鲁兰,氧化产物的产率均在60%以上。不同高碘酸钠与普鲁兰比例所得产物的醛基含量与理论值接近,当高碘酸钠的量增加,产物的醛基含量增加,由此可得到醛基含量20%～80%的一系列双醛普鲁兰。

FTIR分析表明,双醛普鲁兰多糖中具有大量的醇羟基(3700～3200cm和1250～1000Vc-o),同时,在1730(Vc=o)和864(δc=o)处出现醛基的红外吸收峰,表明普鲁兰的部分羟基经氧化成为醛基结构。

2.2 复合支架材料的制备与表征

双醛普鲁兰和胶原在低温(4℃)下可均匀地混合,形成透明的溶液。为了使醛基与胶原的氨基充分反应交联,将混合溶液于4℃放置24h。随后,将混合物升温到37℃凝胶化。将凝胶冷冻干燥,即可得到多孔的胶原/普鲁兰复合支架材料。双醛普鲁兰的醛基可与胶原的氨基间发生反应而交联[6]。由TNBS分析法测定胶原中未反应的胶原氨基量,可计算交联度。结果表明,当双醛普鲁兰的醛基含量由20%左右上升到40%左右时,交联度相应的由17%上升到33%。然而,当醛基含量进一步升高到80%左右,复合支架材料的交联度只提高到37%。这可能是因为分子中的醛基和残余未氧化的羟基可形成半缩醛结构,消耗了相当部分的醛基,使醛基含量较高的双醛普鲁兰中部分醛基不能参与交联反应。

图1为不同醛基含量的双醛普鲁兰制备的复合水凝胶的断面SEM图像。从图中可以看到,所有支架材料都具有相互贯穿的多孔结构,其孔径大约为300μm左右,几种材料之间没有明显的区别。这种孔径范围对细胞的播种和培养比较适宜,可以让细胞较容易地渗透迁移到支架材料的内部,使细胞播种均匀,从而有利于培养构建工程化的活性组织。

吸水率测定结果表明,复合支架材料和吸水能力与纯胶原支架材料相当,其吸水率都在98%以上,表明其具有良好的细胞培养介质通透性,适合细胞生长增殖。随着复合支架材料在PBS中时间的增加,逐渐开始降解。图2显示了复合支架材料的降解失重率随PBS溶液中降解时间的变化。在最初几天时间里,几种支架材料之间差别不大。随后,纯胶原支架材料的降解出现明显的加速现象,表明支架材料的结构已经受到一定的破坏。双醛普鲁兰改性的复合支架材料的降解速率有明显减小,而且随双醛普鲁兰中醛基含量的增加,其降解速率呈下降趋势,到14d时,醛基含量80%的双醛普鲁兰制备的复合支架材料重量损失为35%,而纯胶原支架材料的重量损失为78%。与纯胶原支架相比,加入双醛普鲁兰对胶原交联,形成希夫碱结构的复合支架更加稳定,降解率降低,为细胞生长增殖提供了更持久稳定的空间环境。

2.3 细胞相容性

图3为用MTT法测定的细胞毒性评价结果。与空白对照组相比,纯胶原支架材料表现出一定的细胞增殖促进作用,具有良好的生物相容性。在24h时,醛基含量20%和40%的双醛普鲁兰/胶原复合支架材料的细胞生长情况与纯胶原支架相似,与空白对照比较有一定的提高。醛基含量较高(60%,80%)的双醛普鲁兰/胶原复合支架材料的细胞增殖略低于纯胶原支架材料,但仍然高于空白对照,表明其对细胞增殖没有抑制。48h后,各组复合支架材料的细胞增殖情况趋于一致,均略低于纯胶原支架组,说明通过双醛普鲁兰的交联,减少了复合支架中溶出物的量。但与空白对照组比较,各复合支架材料组的细胞增殖均略有提高,表明其具有良好的生物相容性。

3 结语

由天然普鲁兰多糖经高碘酸钠氧化制备的双醛普鲁兰,其醛基和胶原的氨基反应形成交联,与传统的碳化二亚胺,戊二醛等交联试剂相比,有利于降低支架材料的细胞毒性,是一种有用的交联途径。双醛普鲁兰/胶原复合支架材料相比纯胶原支架材料的降解大大减慢,提供了更长久的适合细胞生长增殖的支架环境,可望在组织工程领域具有良好的应用前景。

[1]K.A.Faraj,T.H.van Kuppevelt,W.F.Daamen.Construction of collagen scaffolds that mimic the three～dimensional architecture of specific tissues[J].Tissue Eng,2007,13:2387.

[2]S.R.Hong,M.S.Chong,S.B.Lee,Y.M.Lee,et al.Biocompatibility and biodegradation of cross～linked gelatin/hyaluronic acid sponge in rat subcutaneous tissue.J.Biomater.Sci[J].Polymer Edn,2004,15:201.

[3]N.E.Vrana,N.Builles,H.Kocak,EDC/NHS cross～linked collagen foams as scaffolds for artificial corneal stroma.J.Biomater.Sci[J].Polymer Edn,2007,18:1527.

[4]T.D.Leathers.Biotechnological production and applications of pullulan[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2003,62:468.

[5]D.Bruneel,E.Schacht.Chemical modification of pullulan:Periodate oxidation[J].Polymer,1993,34:2628.

[6]S.V.Kanth,A.Ramaraj,J.R.Rao,et al.Stabilization of type I collagen using dialdehyde cellulose[J].Process Biochemistry,2009,44:869.

Preparation and Characterization of Collagen/dialdehyde Pullulan Complex Scaffold Materials

FENG Yujie LU Wei YAN Xiaoli FAN Yujiang

National Engineering Research Center for Biomaterials,Sichuan University Chengdu 610064,China

Collagen scaffolds have been promising to provide suitable environment for 3D cell culture in tissues engineering.However,its rapid degradation and week mechanical properties remained problems that limited many of its applications.In this study,collagen/dialdehyde pullulan complex scaffolds were prepared by mixing collagen with dialdehyde pullulan with different aldehyde contents to chemically cross-link the collagen through the formation of Schiff’s base between the amino on collagen and the aldehyde on pullulan.With higher aldehyde content in pullulan,the complex scaffold thus formed showed improved degradation resistance.The MTT assay indicates that the cell proliferation on the complex scaffolds had not different with that on the pure collagen scaffold.These complex scaffolds are suitable for 3D cell culture in tissue engineering.

Dialdehyde pullulan;Collagen;Scaffold;Degradation;Tissue engineering

TB383.1

A

1674-0742(2010)07(c)-0010-03

国家863计划重大项目(2006AA02A125)资助研究课题。

冯玉杰:女,硕士研究生,1984～,四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心,四川南充,研究方向:生物医学材料。

2010-04-20