响应面法优化阴离子淀粉微球吸附性能研究

薛 博，李新华,*，朱旻鹏

(1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161；2.沈阳师范大学化学与生命科学学院，辽宁 沈阳 110034)

响应面法优化阴离子淀粉微球吸附性能研究

薛 博1，李新华1,*，朱旻鹏2

(1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161；2.沈阳师范大学化学与生命科学学院，辽宁 沈阳 110034)

以精氨酸为模型药物，采用响应面法优化阴离子淀粉微球的吸附性能。在单因素试验的基础上选取离子化剂用量、反应温度、浸泡时间和反应时间为影响因子，应用中心组合(CCD)进行四因素五水平的试验设计，以阴离子淀粉微球吸附量作为响应值，进行响应面分析(RSA)。结果表明，阴离子淀粉微球吸附精氨酸含量的最佳优化条件为三聚磷酸钠用量0.82g、反应温度80.52℃、浸泡时间12h、反应时间1h。精氨酸吸附量预测值为3.341mg/g，验证值为3.308mg/g，与预测值相差0.033mg/g，比阴离子化前吸附量提高了95.16%。

阴离子淀粉微球；吸附载药；精氨酸

淀粉微球因具有生物相容性、生物降解性、无毒性、贮存稳定、原料来源广泛、价格低廉等优点，已作为靶向制剂的药物载体在医药卫生领域得到广泛研究和应用[1]。目前，淀粉微球的载药主要通过其在药液中溶胀吸附的方式载药，由于微球与药物间仅存在单纯的物理吸附，载药量很有限，药物缓释性差，影响其使用效果。提高淀粉微球对药物的吸附性能已经成为研究热点。采用减小微球粒径，增加微球的比表面积的手段可提高微球对药物的吸附，但代价很高[2-4]，而对微球进行离子化，使其能够吸附带相反电荷的离子型药物，是一种改善微球吸附性能的有效方法，目前对淀粉微球进行离子化的研究报道较少，且多以亚甲基蓝等带电荷染料为模型药物研究微球的吸附性，缺乏离子化微球对药物的吸附研究[5-9]。实验以可溶性淀粉为原料，环氧氯丙烷为交联剂，采用反相悬浮法合成中性淀粉微球。通过实验选择吸附性能最好的中性淀粉微球，以三聚磷酸钠为离子化剂对微球进行阴离子化，以带正电荷的精氨酸为模型药物，采用响应面法优化微球的吸附性能，为阴离子淀粉微球做为药物载体提供理论和实践上的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

可溶性淀粉、乳化剂Span60、液体石蜡、氢氧

化钠、环氧氯丙烷、乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮、三聚磷酸钠、精氨酸，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1600紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；HH-6型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；JB90-S数字显示转速电动搅拌机 上海标本模型厂制造；NICLET380傅里叶红外光谱仪 Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉微球的制备

准确量取60mL液体石蜡倒入烧杯中，加入一定量的Span60，于60℃水浴加热使Span60溶解，然后倒入三口烧瓶中，于50℃恒温水浴保温搅拌作为油相。取可溶性淀粉(提前烘干水分)，配成质量分数10%淀粉溶液，用2mol/L NaOH溶液调节pH12，淀粉溶液于电炉上加热糊化至透明，冷却至50℃，用刻度吸管吸取20mL淀粉溶液。逐滴加入环氧氯丙烷，磁力搅拌600r/min、50℃保温，回流，反应5h。反应结束后，3000r/min离心10min，依次用乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮洗涤，40℃真空干燥得到淀粉微球。

1.3.2 阴离子淀粉微球的制备

精确称取1g中性淀粉微球，加入20mL蒸馏水，加入一定量三聚磷酸钠(Na5P3O10)，搅拌分散均匀，调节pH11.5，浸泡一段时间，然后4000r/min离心5min，用体积分数95%乙醇洗涤3次，离心，淀粉在45℃烘箱中干燥30min，然后迅速升温，高温反应一定时间，即得阴离子淀粉微球。

1.3.3 阴离子淀粉微球吸附性能测定

以蒸馏水为介质，配制20μg/mL的精氨酸溶液。取0.5g干燥的阴离子淀粉微球于100mL容量瓶中，加入精氨酸溶液100mL，30℃恒温避光吸附1h。取吸附液10mL，0.45μm滤膜过滤，采用茚三酮比色法测滤液精氨酸的吸附量。

1.3.4 单因素试验

固定其他因素不变，考察三聚磷酸钠用量、反应时间、浸泡时间和反应温度4个影响因素对阴离子淀粉微球吸附性能的影响规律，以吸附量为指标进行试验测定。

1.3.5 阴离子化淀粉微球的红外光谱分析

分别取可溶性淀粉、淀粉微球(中性微球)和阴离子淀粉微球各约1mg，置玛瑙研钵中，加入干燥的KBr细粉150～200mg，充分研磨混匀，在烘箱中干燥7～ 8min，移置于压模中压片。将样品进行IR分析，记录500～4000cm-1范围的红外光谱图。

1.3.6 响应面法对阴离子淀粉微球吸附性能的优化

综合单因素试验结果，应用中心组合(central composite design，CCD)设计原理，选取三聚磷酸钠用量、反应时间、浸泡时间和反应温度4个影响因素，在单因素试验的基础上采用四因素五水平的响应面分析方法，对阴离子微球的制备工艺进行优化，进一步提高其吸附能力，试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析因素及水平Table 1 Variables and levels in the 4-variable, 5-level CCD

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 三聚磷酸钠用量对阴离子淀粉微球吸附性能的影响

图1 不同三聚磷酸钠用量对阴离子淀粉微球吸附性能的影响Fig.1 Effect of sodium tripolyphosphate on the adsorption capacity

由图1可知，随着三聚磷酸钠用量的增加，阴离子淀粉微球的吸附量呈现先增大后减小的趋势，当三聚磷酸钠用量为0.6g时，微球对精氨酸吸附量达到最大值3.65mg/g。三聚磷酸钠用量的增加会使微球带有更多的负电荷，增加了微球与精氨酸间的静电引力，使吸附量增加。

2.1.2 反应时间对阴离子淀粉微球吸附性能的影响

由图2可知，反应时间在1～3h范围内变化对精氨酸吸附量的影响呈现一定的波动性，吸附量最大值出现在1.5h，继续延长反应时间阴离子淀粉微球吸附量变化不大，而且随着反应时间的延长，产品颜色逐渐变黄，这是因为当反应时间过长时，淀粉分子发生降解或焦化。

图2 不同反应时间对阴离子淀粉微球吸附性能的影响Fig.2 Effect of reaction time on the adsorption capacity

2.1.3 浸泡时间对阴离子淀粉微球吸附性能的影响

图3 不同浸泡时间对阴离子淀粉微球吸附性能的影响Fig.3 Effect of soaking time on the adsorption capacity

由图3可知，随着浸泡时间的增加，阴离子淀粉微球的吸附量呈上升趋势，但浸泡时间超过10h后吸附量不再增加。

2.1.4 反应温度对阴离子淀粉微球吸附性能的影响

图4 不同反应温度对阴离子淀粉微球吸附性能的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on the adsorption capacity

由图4可知，随着反应温度的升高，阴离子淀粉微球对精氨酸的吸附量先升高后降低。当反应温度达到100℃时，阴离子淀粉微球吸附量达到最大，这是因为在一定温度范围内，温度升高，能量增加，使分子的活性增加，有利于淀粉链间氢键断裂，从而可以让更多的磷酸盐分子接近羟基进行反应，使微球带有更多负电荷，但当反应温度过高时，淀粉分子热降解，甚至可能焦化，因而反应温度超过100℃后微球吸附量不断减小。

2.2 红外光谱分析

图5 可溶性淀粉、中性淀粉微球和阴离子淀粉微球红外光谱图Fig.5 Infrared spectra of soluble starch microspheres, neutral starch microspheres and anionic starch microspheres

可溶性淀粉、淀粉微球(中性微球)和阴离子化淀粉微球的红外光谱图见图5。由图5可知，3条红外光谱曲线在3440cm-1附近出现了—OH伸缩振动吸收峰，表明官能团—OH在交联前后都存在，随着交联程度的增加，红外光谱的羟基峰逐渐变窄；阴离子化反应后的红外光谱曲线在1200cm-1附近出现新的吸收峰。从脂肪磷化合物基团的振动规律来看，磷酰基P=O的伸缩振动吸收带，在不同结构的化合物中位置分布很宽，可在1400～1175cm-1之间出现，因此可以认定，阴离子化微球在1215cm-1附近出现的峰为P=O的伸缩振动吸收峰[10]。并且淀粉红外光谱中其他官能团的特征吸收峰并没有明显的变化。由此可以推断，淀粉的羟基确实已经被取代。说明离子化处理后的淀粉并未破坏原淀粉的基本结构，阴离子化反应只是在原来的淀粉分子链上增加了新的基团。

2.3 中心试验设计与响应面分析

2.3.1 响应曲面试验设计

对三聚磷酸钠用量、反应时间、浸泡时间和反应温度4个影响因素使用Design-Expert 7.1软件设计四因素五水平共30个试验(6个中心点)的响应面分析试验。这30个试验点可分为两类：一是析因点，自变量取值在各因素所构成的三维顶点，共24个析因点；二是零点，为区域的中心点，零点试验重复6次，用以估计试验误差，阴离子淀粉微球对精氨酸的吸附量为响应值(指标值)，响应面试验数据见表2。

表2 响应中心组合试验设计及结果Table 2 CCD matrix and corresponding experimental results of the adsorption capacity

2.3.2 建立模型方程与显著性检验

表3 回归方程的方差分析表Table 3 Variance analysis for the fitted regression equation

应用Design-Expert 7.1对响应面试验数据进行分析和显著性检验，结果见表3。

采用Design-Expert 7.1软件对响应面试验数据进行分析后，使用“Quadratic”(二次方程式)的数学模型。阴离子淀粉微球对精氨酸吸附量的数学模型如下：

对模型进行方差分析结果(表3)可知，用上面所得的方程描述因子回归得P＜0.001，方程回归极显著，一次项、二次项也极其显著，说明用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著，即这种试验方法是可靠的。从回归方程各项方差的进一步检验也可知，X1和X3是影响阴性淀粉微球吸附量的关键因子。X1对试验结果影响最显著(P＜0.001)，其次是X3(P＜0.001)；X2和X4对试验结果影响不太显著。另外，方程的失拟项P＝0.0991＞0.05，不显著，表明该方程对试验拟合情况好，试验误差小，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测。回归模型预测的最佳阴离子淀粉微球吸附量工艺条件为三聚磷酸钠用量0.82g、反应温度80.52℃、浸泡时间12h、反应时间1h。

2.3.3 阴离子淀粉吸附量的响应面曲面分析与优化

图6 Y = f(X1, X2)的响应面图Fig.6 Response surface stereogram of Y = f(X1, X2)

图7 Y = f(X1, X3)的响应面图Fig.7 Response surface stereogram of Y = f(X1, X3)

图8 Y = f(X1, X4)的响应面图Fig.8 Response surface stereogram of Y = f(X1, X4)

图9 Y = f(X2, X3)的响应面图Fig.9 Response surface stereogram of Y = f(X2, X3)

图10 Y = f(X2,X4)的响应面图Fig.10 Response surface stereogram of Y = f(X2,X4)

图11 Y = f(X3, X4)的响应面图Fig.11 Response surface stereogram of Y = f(X3, X4)

阴离子淀粉吸附量优化的响应曲面及其等高线如图6～11所示。6组图直观地反映了各因素对响应值的影响。比较6组图可知，反应时间(X2)与浸泡时间(X3)、浸泡时间(X3)和反应温度(X4)交互作用显著，对阴离子淀粉吸附量影响较为显著，表现为曲线较陡。

为检验RSA法的可靠性，采用上述最优离子化条件制备阴离子化淀粉微球，测定其对精氨酸吸附量为3.308mg/g，与理论值差0.033mg/g左右，较中性淀粉微球吸附量1.695mg/g，提高了95.16%。

3 结 论

基于试验设计软件Design-Expert 7.1，通过二次回归设计得到了阴离子淀粉微球对精氨酸吸附量与阴离子化剂用量、反应时间、浸泡时间、反应温度关系的回归模型，经检验证明该模型合理可靠，得到的优化工艺参数为三聚磷酸钠用量0.82g、反应温度80.52℃、浸泡时间12h、反应时间1h，在此条件下，精氨酸吸附量验证值为3.308mg/g，较中性淀粉微球吸附量提高了95.16%。因此，采用RSA法优化阴离子淀粉微球得到的条件参数准确可靠，微球吸附性能提高显著。

[1]马素德, 郭焱. 淀粉微球的用途及发展建议[J]. 化工新型材料, 2003, 31(10): 6-8.

[2]沈钟, 赵振国, 王果庭. 胶体与表面化学[M]. 北京: 化学工业出版社, 2004: 478-479.

[3]李静茹, 金征宇. 可降解淀粉微球的性能研究[J]. 食品与生物技术学报, 2006, 25(3): 29-32.

[4]史黎明, 刘爱芳, 方春梅, 等. 淀粉微球的制备及其吸附香精性能[J].西部粮油科技, 1998, 23(2): 30-31.

[5]崔福德. 药剂学[M]. 5版. 北京: 人民卫生出版社, 2003: 249.

[6]苏绣霞, 李仲谨, 马素德, 等. 载药淀粉微球合成条件的研究[J]. 化工新型材料, 2005, 33(6): 44-46.

[7]YAO Weirong, YAO Huiyuan. Adsorbent characteristics of porous starch [J]. Starch/Starke, 2002, 54(6): 260-263.

[8]PERESWETOFF-MORATH L. Microspheres as nasal drug delivery systems[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 1998, 29(1/2): 185-194.

[9]LIU Wanhui, SONG J L, LIU Ke, et al. Preparation and in vitro and in vivo release studies of Huperzine A loaded microspheres for the treatment of Alzheimer s disease[J]. Journal of Controlled Release, 2005, 107(3): 417-427.

[10]GREGA T, NAJGEBAUER D, SADY M, et al. Polymeric complexes from casein and starch phosphate: Characteristics and enzyme susceptibility [J]. Journal of Polymers and the Environment, 2004, 12(1): 17-25.

Optimization of Adsorption Capacity of Anionic Starch Microspheres Using Response Surface Methodology

XUE Bo1，LI Xin-hua1,*，ZHU Min-peng2
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China；2. College of Chemistry and Life Sciences, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

Response surface methodology (RSM) was used to optimize the adsorption capacity of anionic starch microspheres to arginine used as a drug model. A series of single-factor experiments was carried out to investigate the respective effects of 4 independent variables, including sodium tripolyphosphate amount, reaction temperature, length of soaking time and length of reaction time. Subsequently, a mathematical mode for the adsorption capacity as a function of the above variables was established based on a 4-variable, 5-level central composite design (CCD). Finally, the interactive effects of the independent variables on the adsorption capacity were examined using response surface analysis. The results showed that the optimal values of sodium tripolyphosphate amount, reaction temperature, length of soaking time and length of reaction time were determined to be 0.82 g, 80.52 ℃, 12 h and 1 h, respectively. Under the optimized parameters, the adsorption capacity was predicted to be 3.341 mg/g and observed to be 3.308 mg/g, 0.033 mg/g higher than the predicted value, with an increase by 95.16% than before the optimization.

anionic starch microspheres；adsorption medicament；arginine

TQ028.15

A

1002-6630(2010)10-0163-05

2009-08-07

薛博(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品深加工与转化。E-mail：xuebo0601@hotmail.com

*通信作者：李新华(1955—)，男，教授，博士，研究方向为农产品深加工与转化。E-mail：Lixh.syau@163.com