SPME-GC-MS分析近江牡蛎酶解液挥发性风味成分

刘晓丽，解万翠，杨锡洪*，章超桦

(水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088)

SPME-GC-MS分析近江牡蛎酶解液挥发性风味成分

刘晓丽，解万翠，杨锡洪*，章超桦

(水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088)

为得到风味良好的牡蛎酶解液，将新鲜的近江牡蛎肉经木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解，采用固相微萃取-气相色谱-质谱(SPME-GC-MS)联用法分析、鉴定牡蛎肉原料和酶解液的挥发性风味成分，探讨酶解对牡蛎风味的影响。经NIST 98质谱数据库检索和文献对照，3个样品分别检出57、60、62种成分，主要有烃类、醇类、醛类、酮类和含硫化合物等，它们的协同作用构成了牡蛎及其酶解液的特征气味；其中牡蛎肉含有较多的酮类化合物，而酶解后则含有较多的醛类和脂类化合物，3个样品中均检出了较多的醇类化合物，归一化含量分别高达40.24%、41.20%和43.28%，中性蛋白酶制备的酶解液比木瓜蛋白酶制备的酶解液风味更加柔和。结果表明：酶解反应能够保持并改善牡蛎的风味，所制备的酶解液具有较好的应用前景。

近江牡蛎；酶解；固相微萃取；气相色谱-质谱法；挥发性风味成分

牡蛎(Concha Ostreae)，俗称海蛎子、蚝等，是著名的海产品，为世界第一大养殖贝类，世界濒海各国几乎都有盛产，在我国广东、广西、福建、浙江、台湾等沿海地区都进行大量人工养殖。目前已发现牡蛎有100多种，中国沿海所产的牡蛎约有20多种[1-2]，而作为主要的养殖种类的近江牡蛎(Ostrea rivularis Gould)不仅肉质鲜美，而且营养丰富，除含有丰富的蛋白质(50.63%)、维生素和糖原(22.41%)等营养成分外，还富含多种维生素及铜、铁、锌、碘等微量元素及人体必需的10多种氨基酸，其中含碘量比牛奶和蛋黄高出200倍，尤其是含有丰富的牛磺酸、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等不饱和脂肪酸，具有很高的营养价值[3-5]。当前国内外除将牡蛎作为海味直接食用外，通过用蛋白酶对牡蛎进行酶解，研制出了营养口服液[6]、牡蛎酶解液营养粥[7]及蚝油调味料[8]等产品，将牡蛎肉经酶解、脱腥、调配等工艺，对其进行深加工利用，生产高档天然的海鲜风味料, 具有很高的附加值[9]。而风味是影响食品可接受性的一个重要因素，因此本实验拟采用先进的仪器手段，对牡蛎肉及其酶解液的挥发性香气成分进行SPME-GC-MS分析和鉴定，探索风味组成与食品感官属性的关系，旨在为牡蛎的深加工利用提供更多的基础数据[10-14]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜近江牡蛎 湛江市购。

木瓜蛋白酶(食品级，800000U/g)、中性蛋白酶(食品级，200000U/g) 广西南宁庞博生物工程有限公司；氢氧化钠、盐酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Trace DSQ GC-MS气相色谱-质谱联用仪 美国Finnigan公司；SPME(含100μm PDMS萃取头) 美国Supelco公司；HHS型电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TDL-5-A低速台式离心机 上海安亭仪器有限公司。

1.3 样品制备方法

样品1：取新鲜近江牡蛎肉，匀浆，待测；样品2：取新鲜近江牡蛎肉，匀浆，用蒸馏水调料液比为1:3，以1mol/L氢氧化钠和1mol/L盐酸调pH6.0，添加木瓜蛋白酶进行恒温酶解，蛋白中加酶量2000U/g，温度50℃，反应时间4h，酶解后的酶解液在沸水浴下灭酶10min，冷却后于4500r/min离心15min，取上清液保存待测；样品3：取新鲜近江牡蛎肉，匀浆，用蒸馏水调料液比为1:3，以1mol/L氢氧化钠和1mol/L盐酸调pH 7.0，添加中性蛋白酶进行恒温酶解，蛋白中加酶量2000U/g，温度50℃，反应时间4h，酶解后的酶解液在沸水浴下灭酶10min，冷却后于4500r/min离心15min，取上清液保存待测。

1.4 挥发性成分的捕集

采用固相微萃取法(SPME)吸附挥发性成分。SPME萃取条件：PDMS萃取头(厚度100μm)；萃取温度50℃；萃取时间30min。

将预处理过的3种样品分别放入3支特制的15mL SPME旋盖玻璃瓶中，迅速盖上盖子，在50℃水浴中预热30min。从瓶盖中插入萃取头，吸附30min。待吸附完成后，进样至气相色谱进样口解吸5min，然后经色谱-质谱联用仪分析并鉴定挥发性风味成分。

1.5 挥发性成分的分析鉴定

采用气相色谱-质谱联用仪分离并鉴定挥发性成分，以质谱鉴定结果并结合文献资料进一步分析牡蛎及其酶解液中挥发性化合物的组成及特点。

1.5.1 色谱条件

色谱柱：PEG 20M色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)；程序升温：40℃保持2min，以每分钟6℃的速度升至120℃，再以每分钟10℃升至250℃，保持10min；载气(He)流速0.8mL/min，压力2.4kPa，进样量0.5μL；不分流进样。

1.5.2 质谱条件

电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度200℃；质量扫描范围m/z 33～450，检测器电压350V。

2 结果与分析

2.1SPME-GC-MS总离子流色谱图

近江牡蛎原料和酶解后挥发性成分的GC-MS总离子图如图1所示，各组分质谱经计算机谱库检索及资料分析，分析并鉴定挥发性香气成分，各检出57、60、62种成分，将挥发性成分按照结构分类统计见表1。

图1 3种样品的挥发性成分总离子流色谱图Fig.1 Total ion current (TIC) chromatogram of volatile compounds derived from three kinds of samples

2.2 牡蛎及其酶解液中挥发性成分的特点

经SPME-GC-MS检测，由NIST 98质谱数据库检索和文献对照，3个样品中分别检出57、60、62种成分，包括烃类、醇类、醛类、酮类、酯类、含硫化合物等，结果表明，近江牡蛎肉及其酶解液均含有丰富的挥发性风味化合物。

醇类在牡蛎肉及其酶解液中的含量是最大的，3个样品分别检出了19种，含量分别高达40.24%、41.20%和43.28%，可见，新鲜牡蛎肉中醇类化合物的含量本身就比较丰富，而经木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解后含量明显增加，其中后者增加更明显，例如2-辛烯-1-醇、环戊醇、叔丁醇、1-戊烯-3-醇、正辛醇、1-辛烯-3-醇、正己醇等醇类通常具有芳香、植物香，由于醇类化合物的高含量赋予牡蛎肉原生的柔和的甜瓜味，同时具有蘑菇味和脂味[15-16]。在挥发性醇类中，1-辛烯-3-醇在牡蛎原肉中的含量就高达17.43%，而在用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解后，其含量仍然较高，分别达到了9.19%和12.04%，1-辛烯-3-醇为C8醇，是由一种亚油酸的氢过氧化物的降解产物，能贡献出浓的、似植物的芳香[17]。

续表1

醛类在许多食品的气味中起着关键的作用，3个样品中分别检出了17、18种和21种，其中从新鲜牡蛎肉中测出含归一化量为30.69%，经木瓜蛋白酶水解后含量为29.65%，减少了1.04%，而经中性蛋白酶水解后含量增加到39.29%，说明用中性蛋白酶能够产生较多的醛类化合物。酶解前后含量较多的醛类主要如反-2-辛烯醛类的短链不饱和醛，在三个样品中分别为12.19%、8.67%和11.81%。此外，苯甲醛的含量在酶解前后有明显的不同，如酶解之前为0.80%，而经木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解后，分别增加到3.73%和4.72%，可能是牡蛎肉中含有的大量的不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸在氧气的作用下发生氧化降解而生成各种小分子化合物形成，它们产生清香、果香和坚果香的芳香特质的气味[18]，使酶解液风味更加鲜美。其中己醛、庚醛和辛醛是多不饱和脂肪酸的代谢产物，具有生的或脆水果的气味。

将3个样品中的烃类化合物的归一化含量相比，新鲜牡蛎肉中有10种，占8.91%，而经木瓜蛋白酶水解后，酶解液中的烃类化合物有9种，占6.51%，较前者明显降低。但经中性蛋白酶水解后，其含量高达21.52%，其中主要是含有19.06%的7-甲基-3-亚甲基-1,6-辛二烯，而在其他样品中并未检出，这可能是在酶解加热过程中经热分解而得，其赋予酶解液具有令人愉快的、清淡的香脂气味，但样品3中也未检出，还有待进一步分析。大量的烃类化合物，通常具有清香和甜香的风味，特别是具有支链的烷烃[19]，是由脂质衍生出来的，这些不饱和烃对海产品风味的产生可能起着很重要的作用，例如对二甲苯，在牡蛎原肉中并未检测出，而牡蛎肉经中性蛋白酶水解后其含量为1.55%，这可能是类胡萝卜素降解的产物，也可能是在酶解加热过程中糖或者氨基酸的热降解形成的[20]。

在新鲜牡蛎肉中酮类化合物的含量较其他样品都高，为14.29%，而酶解后分别为3.25%、5.92%，明显没有新鲜肉中的高。例如1-辛烯-3-酮、3-辛酮、2,3-戊二酮等气味均较强烈，它们的存在使得牡蛎肉具有不同的水果香、花香。在贝类中发现的甲基酮(C3～C17)，例如2-庚酮、2-戊酮可能是由其碳链的β氧化，再经脱羧作用形成的，这些化合物具有明显的清香和水果香气，而且随着碳链的增长，有更显著的花香味。

在3个样品中都检测到了挥发性含硫化合物如二甲基硫的存在，在3个样品中的归一化含量分别为5.67%、3.19%和3.77%，经酶解后含量明显降低，多数含硫化合物的气味特征是洋葱味、卷心菜味、或煮沸的硫磺味和臭鸡蛋味，因其阈值低而影响整个食物的香味。

在样品2、3中还分别检测到了1种和3种酯类化合物，样品1中未检测出，这可能是在酶解及加热灭酶过程中形成的。

3 结 论

新鲜牡蛎肉中的挥发性风味成分很丰富，共检出57种化合物，如烃类、酮类、醇类、醛类及含硫化合物等。酶解反应后得到的风味料则含有较多的醇类、醛类、酯类等化合物，提高了香气品质，风味更加柔和，可作为调味品基料使用。

通过比较酶解反应前后的挥发性风味成分的变化，并将结果进行对照表明，新鲜贝类的风味以烃类和酮类化合物为主，而酶解产物则增加了醇类及部分酯类、醛类化合物，使得风味更加柔和。如环戊醇的含量由酶解前的1.5%，酶解后分别增加到4.61%和2.63%。同时，酮类化合物也相对减少，酯类化合物增加，从而使得酶解后的产品较酶解前风味更丰富，柔和。

结果表明，中性蛋白酶所制备的酶解液较木瓜蛋白酶酶解液的风味更好，如醇类、醛类、酯类等化合物的含量都较高，这可能与两种酶的切割位点有关。

综上所述，经蛋白酶水解后的酶解液所具有的独特的风味，是烃类、醇类、醛类、酮类、酯类、含硫化合物等共同作用的结果。得到的产品是一种富有营养的天然海鲜调味料，并具有良好的安全性，可作为复合调味品的基料，具有较好的工业化应用前景。

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Analysis of Volatile Components in Ostrea rivularis Hydrolysates by SPME-GC-MS

LIU Xiao-li，XIE Wan-cui，YANG Xi-hong*，ZHANG Chao-hua
(Key Laboratory of Aquatic Product Advanced Processing of Guangdong Higher Education Institutes, College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

In order to obtain a good flavor oyster hydrolysate, fresh oyster (Crassostrea rivularis Crould) was hydrolyzed by papain and neutral protease. Volatile components in raw material and hydrolysates were analyzed by solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) to explore the effect of hydrolysis processing on flavor compounds. A total of 57, 60, and 62 kinds of volatile compounds in three samples were identified by comparing their mass spectra with NIST mass spectral database. Among these compounds, most of them were hydrocarbons, alcohols, aldehydes, kotones, and sulfuric compounds. The cooperation of these compounds provided a specific flavor of oyster and its hydrolysates. Kotones were the major components in raw material, whereas, aldehydes and esters were the major components in hydrolysates of oyster. Meanwhile, alcohols exhibited higher contents in three samples, and the contents of alcohols in three samples were 40.24%, 41.20% and 43.28%, respectively. Moreover, the hydrolysates obtained from neutral protease exhibited better flavor than the hydrolysates from papain digestion. Therefore, enzymatic hydrolysis reaction can improve the flavor of oyster and the prepared hydrolysates of oyster have promising application potential.

Ostrea rivularis Gould；enzymatic hydrolysis；solid phase micro-extraction (SPME)；gas chromatographymass spectrometry (GC-MS)；volatile flavor components

TS207.3

A

1002-6630(2010)24-0410-05

2010-09-24

农业部“948”项目(2006-G42)；国家现代农业产业技术体系建设专项(贝类，47)

刘晓丽(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为食品加工与保藏。E-mail：lxl525j@163.com

*通信作者：杨锡洪(1963—)，男，副教授，博士，研究方向为食品化学与食品添加剂。E-mail：yangxihong63@163.com