腰果梨抑菌活性物质提取工艺优化

苗子健，李从发，唐艳平，熊海波，侯源源，刘四新*

(海南大学食品学院，海南 海口 570228)

腰果梨抑菌活性物质提取工艺优化

苗子健，李从发，唐艳平，熊海波，侯源源，刘四新*

(海南大学食品学院，海南 海口 570228)

对腰果梨抑菌活性物质的提取工艺进行研究，分析比较提取物对不同测试菌的抑菌效果。以金黄色葡萄球菌和白色念珠菌为指示菌，在单因素试验基础上通过中心组合试验设计分别对黄色、红色两种不同色泽腰果梨进行提取工艺优化。得出黄色腰果梨最佳提取工艺：乙醇体积分数70%，提取温度85℃，料液比1:13.9，提取时间2.65h；红色腰果梨最佳提取工艺：乙醇体积分数70%，提取温度85℃，料液比1:14.5，提取时间2.44h。经工艺优化后腰果梨提取物显著提高了抑菌效果。

腰果梨；抑菌；提取工艺；中心组合试验

腰果(Anacardium occidentale L.)是世界著名四大坚果之一。腰果树是多年生常绿乔木，耐旱、耐瘠，而抗寒力弱，是典型的热带果树[1]。腰果梨是在腰果坚果成熟过程中由花梗膨大而形成的一种梨形“水果”，为腰果生产副产品，约占腰果树总产出量的90%左右[2]。这种柔软多汁的纤维质“水果”含有丰富的营养物质和多酚类物质：水分87.8%、碳水化合物11.6%、蛋白质0.2%、脂肪0.1%，还含有多种维生素和钙、磷、铁等矿物元素，特别富含VC[3-4]。目前对腰果梨的商业利用还不多，国外主要是制作腰果梨汁，国内主要是制作腰果梨酒，果香浓郁，滋味醇厚，风味独特。实践应用表明腰果梨酒对口腔溃疡类疾患具有十分明显的治愈效果。

近几年的研究证实，各种天然物质如大蒜、芦荟、茶叶等的提取物都具有不同程度的抑菌作用[5]，与传统化学抑制剂相比，这类天然抑菌物质来源广泛，加工低廉，且可作为辅助成分改变产品的风味，如在牙膏中添加荷叶提取物等[6]。本研究主要对腰果梨鲜果的抑菌活性进行探索，研究腰果梨抑菌活性成分的提取优化情况，为腰果梨资源的高效利用及腰果梨酒的市场开拓奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腰果梨由海南省腰果研究中心提供。

唾液链球菌CGMCC 1.2498、金黄色葡萄球菌CGMCC 1.72 中国科学院微生物研究所；表皮葡萄球菌CBL-R、表皮葡萄球菌TS5 南京农业大学生命科学学院；白色念珠菌、变形杆菌、大肠杆菌 海南大学食品学院微生物实验室。

NA培养基、NB培养基、PDA培养基、LB培养基[7]、脑心浸萃琼脂培养基和脑心浸萃液态培养基。

1.2 仪器与设备

HWS智能型恒温恒湿培养箱 宁波江南仪器厂；摇床 太仓市博莱特实验仪器厂；超净工作台 苏州佳宝净化工程设备有限公司；超声波清洗机 宁波海曙五方超声设备有限公司；电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂；G154DW立式高压灭菌器 美国ZEALWAY仪器公司；RE-5298旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；722可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；粉碎机 青州三阳包装设备有限公司；电子天平、实验室pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；XW-80A旋涡混合器上海精科实业有限公司；电子万用炉 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腰果梨提取物制备

将腰果梨洗净后60℃烘干，粉碎，过40目筛[8]，继续烘干至质量恒定。称取不同颜色(红、黄)的腰果梨10g，用提取剂(如乙醇溶液)进行水浴回流提取。真空抽滤后将干粉回收，用同样的方法进行二次提取，合并两次提取液，减压浓缩至1g/mL(指每毫升提取物含1g腰果梨干粉)[9-10]。

1.3.2 抑菌试验

标准比浊液的配制：取质量浓度11.75g/L BaCl2· 2H2O溶液0.5mL，加入到99.5mL 0.184mol/L H2SO4溶液中，装入试剂瓶或均匀分装至试管内密封保存。该浊度相当于抑菌试验所需菌悬液浓度1.5×108CFU/mL[11]。

首先将各供试菌用相应的液态培养基于37℃、140r/ min活化18～24h，然后将活ss化后的菌液用无菌生理盐水稀释至标准比浊管浊度(通过可见分光光度计560nm测透光率)。白色念珠菌直接从PDA斜面上刮取菌苔混入无菌生理盐水中，漩涡震荡均匀后与标准管比浊，通过血球计数板校正菌悬液浓度。吸取1mL菌悬液，加入到50℃已融化的琼脂培养基中。充分混匀后倒入内径一致的无菌平皿内，做三组平行，待用。

将直径5.5mm的无菌干滤纸片浸泡于腰果梨提取物中，取出后以无菌风吹干，再通过无菌操作贴放于上述琼脂平板上[12]。20min后将培养皿倒置、于37℃或28℃(白色念珠菌)恒温培养。24h后观察并测量抑菌圈直径。每个平皿均以400U/mL的庆大霉素作阳性对照，以相同提取条件下的空白提取液作阴性对照。

1.3.3 单因素试验

对提取溶剂、溶剂体积分数、提取温度、料液比、提取时间、提取pH值不同的提取条件进行试验研究。以金黄色葡萄球菌和白色念珠菌作为指示菌，将不同条件下的提取物分别进行抑菌试验。

1.3.4 提取工艺参数优化

根据单因素试验结果，采用中心组合设计法研究溶剂体积分数、提取温度、料液比、提取时间对抑菌效果的综合影响，用SAS Windows 9.0进行数据处理以优化腰果梨的提取工艺条件。因素编码见表1。

表1 中心组合设计因素水平表Table 1 Factors and levels of central composite experiments

2 结果与分析

2.1 不同溶剂提取物对抑菌作用的影响

由表2和表3可知：70%乙醇提取物对各供试菌的抑制作用均优于其他几种溶剂。通过Duncan比较发现：对于金黄色葡萄球菌和变形杆菌的抑制作用，70%乙醇与其他几种溶剂间均存在显著性差异。

表2 黄色腰果梨不同溶剂提取物抑菌圈直径Table 2 Inhibitory zone diameters of yellow cashew apple extracts using different extraction solventsmm

表3 红色腰果梨不同溶剂提取物抑菌圈直径Table 3 Inhibitory zone diameters of red cashew apple extracts using different extraction solventsmm

2.2 乙醇提取物对不同供试菌抑菌效果的比较

在提取温度90℃、pH3，料液比1:10和提取时间1.5h的提取条件下，研究70%乙醇提取物对各供试菌的抑菌效果。结果表明(图1)其对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌具有很强的抑菌效果。经Duncan比较得知：这两株菌与其他各供试菌之间具有显著性差异，故选用金黄色葡萄球菌和白色念珠菌作为提取试验的指示菌；黄色腰果梨与红色腰果梨提取物的该项抑菌结果一致、之间没有显著性差异。

图1 腰果梨70%乙醇提取物抑菌效果比较Fig.1 Antibacterial effects of extracts from yellow and red cashew apple using 70% ethanol extraction

2.3 提取单因素试验

2.3.1 溶剂体积分数对抑菌效果的影响

如图2所示：随着溶剂体积分数的增大，腰果梨提取物抑菌活性先增大再减小，乙醇体积分数70%时，腰果梨提取物抑菌效果最好。据相似相溶原理推测，可知70%乙醇极性较适合腰果梨中抑菌物质的提取。

图2 溶剂体积分数对腰果梨抑菌效果的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on antibacterial activity of extract from cashew apple

2.3.2 提取温度的影响

随提取温度升高抑菌作用逐渐增强(图3)，当温度达90℃时，提取物对两种菌的抑菌圈直径均达最大，抑菌效果最好，但随着温度继续升高，抑菌效果反而降低；这可能是高温破坏了抑菌物成分的结构。

图3 提取温度对腰果梨抑菌效果的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on antibacterial activity of extract from cashew apple

2.3.3 提取料液比的影响

腰果梨提取物的抑菌作用随着料液比的增加而增强，但到一定程度，又有所下降(图4)。一般来说，溶剂量越大，有效成分浸出越完全，提取率亦越大；但过大的料液比也会使杂质大量浸出，不仅造成溶剂和能量的浪费，也给后续的浓缩工作增加困难[13]。综合考虑，料液比宜在1:5～1:20之间选择。

图4 提取料液比对腰果梨抑菌效果的影响Fig.4 Effect of material-liquid ratio on antibacterial activity of extract from cashew apple

2.3.4 提取时间的影响

图5 提取时间对腰果梨抑菌效果的影响Fig.5 Effect of extraction time on antibacterial activity of extract from cashew apple

图5 显示，随提取时间的延长，提取物抑菌效果增强的趋势并不是很明显。当时间达1.5h左右时，抑菌圈直径较大，抑菌效果较好，但时间继续延长，抑菌圈直径不再增加反而略微减小，提取物抑菌效果降低，其原因可能是抑菌成分在长时间的加热过程中其抑菌活性被破坏。

2.3.5 提取pH值的影响

表4 腰果梨的中心组合设计方案及结果Table 4 Design and results of central composite experiments for optimizing the extraction of antibacterial materials from cashew apple

图6 提取pH值对腰果梨抑菌效果的影响Fig. 6 Effect of extraction pH value on antibacterial activity of extract from cashew apple

由图6可知：随pH值降低，提取物抑菌圈直径呈增大趋势。但在pH1条件下，阴性对照出现阳性结果，故不予考虑。通过Duncan比较发现：pH2与其他提取pH值之间均具有显著性差异，所以选择提取pH值为2。

2.4 腰果梨抑菌物质提取工艺优化

上述单因素试验结果表明，溶剂体积分数、提取温度、料液比、提取时间等对腰果梨抑菌活性物质的提取均具有不同程度的影响。考虑到交互作用的影响，本研究以对金黄色葡萄球菌与白色念珠菌抑菌圈直径之和为指标，采用中心组合试验设计法对腰果梨提取工艺进行优化，试验结果见表4。

以黄色腰果梨为例，回归分析如表5所示：当P＜0.05 即表示该项指标显著，P＜0.01，则表明该指标高度显著[14]。由表5中P值可以知道，在所选的各因素水平范围内，对结果的影响排序为：料液比＞提取温度＞提取时间＞溶剂体积分数。其中，X12、X22和X32对Y值(抑菌圈直径之和)的影响极显著，X2、X3和X42对Y值的影响显著。可见，试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大影响。响应面分析所选的4个因素(溶剂体积分数、提取温度、料液比、提取时间)之间的交互效应比较小，这一结论也可由响应面分析图得到。

表5 黄色腰果梨抑菌物质提取的方差分析Table 5 Variance analysis of central composite experiments for optimizing the extraction of antibacterial materials from yellow cashew apple

由图7可知：在所选腰果梨提取范围内存在极值，即响应面最高点。腰果梨提取温度过高，时间过长可导致抑菌效果呈缓慢下降趋势，提取温度在84～88℃附近出现峰值。在一定提取时间条件下，提高溶剂体积分数可以使抑菌效果增强，但是体积分数过高，反而会降低抑菌效果。溶剂的体积分数在70%附近出现极值，这一结果与单因素试验结果一致。温度和时间、温度和料液比以及体积分数和时间之间的交互作用不大。料液比和提取温度对响应值影响较大，与方差分析的结果相吻合。

图7 试验因素交互作用的响应面分析图Fig.7 Response surface analysis plots for the effects of cross-interactions among factors on antibacterial activity of extracts from cashew apple

图9 腰果梨提取优化后的抑菌试验研究Fig.9 Inhibitory effects of yellow and red cashew apple extracts using optimal extraction processing on test bacterial strains

LINGO语言分析所得到的最佳方案为：黄色腰果梨：乙醇体积分数70%，提取温度85℃，料液比1:13.9，提取时间2.65h；红色腰果梨：乙醇体积分数70%，提取温度85℃，料液比1:14.5，提取时间2.44h。分别对最佳方案进行实验验证，结果显示提取物对金黄色葡萄球菌与白色念珠菌的抑菌圈直径之和分别为25.2mm与26.2mm，与理论值的24.82mm和25.21mm相差不大，因此，该方法对腰果梨提取条件的优化是可行的，具有实际应用价值。

2.5 优化后的提取物对供试菌的抑制效果

图8 腰果梨提取工艺优化后对供试菌的抑制作用Fig.8 Inhibitory effects of yellow and red cashew apple extracts using optimal extraction processing on test bacterial strains

如图8所示：两种不同颜色的腰果梨经提取优化后对供试菌的抑制作用均有不同程度的增强。与工艺优化前相比，提取物对表皮葡萄球菌CBL-R、表皮葡萄球菌TS5、白色念珠菌、变形杆菌和大肠杆菌的抑菌效果提高较明显。黄色腰果梨分别提高24.3%、8.4%、13.3%、25.3%和13.5%；红色腰果梨分别提高27.8%、17.1%、19%、32.5%和10.5%。图9为优化提取条件后，红、黄腰果梨提取物抑菌试验的照片(以庆大霉素作阳性对照，空白提取液作阴性对照)。

以黄色腰果梨为例，将工艺优化前后腰果梨的抑菌效果进行差异分析(图10)。Duncan比较发现：对表皮葡萄球菌CBL-R、表皮葡萄球菌TS5、白色念珠菌、变形杆菌和大肠杆菌的抑制作用较工艺优化前均具有显著性差异。证实了在抑菌效果方面，该提取工艺与优化前相比得到了显著性提高。

图10 黄色腰果梨提取优化前后抑菌效果的比较Fig.10 Comparison on inhibitory effects of yellow cashew apple extracts using non-optimal and optimal extraction processing on test bacterial strains

3 结论与讨论

抑菌试验结果表明，腰果梨对多种常见病原菌特别是口腔病原菌具有明显的抑制作用，推测其含有多种抑菌活性物质。先后通过单因素试验、中心组合试验设计法优化了腰果梨抑菌活性物质的提取工艺，获得了最佳提取工艺参数。黄色腰果梨最佳提取工艺：乙醇体积分数70%，提取温度85℃，料液比1:13.9，提取时间2.65h；红色腰果梨最佳提取工艺：乙醇体积分数70%，提取温度85℃，料液比1:14.5，提取时间2.44h。提取条件经优化后，腰果梨提取物对表皮葡萄球菌CBL-R、表皮葡萄球菌TS5、白色念珠菌、变形杆菌和大肠杆菌的抑菌效果明显增强。黄色腰果梨分别提高24.3%、8.4%、13.3%、25.3%和13.5%；红色腰果梨分别提高27.8%、17.1%、19%、32.5%和10.5%。

实验选择的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、唾液链球菌等是人类口腔中常见的致病菌[15]。许多同类研究也已证实植物中的肽类、不饱和长链脂肪酸、醛、生物碱、挥发油、酚和水溶性或醇溶性化合物[16-18]对多种感染人类与动物的细菌、真菌和病毒具有显著抑制作用，在治疗实践中具有重要意义。由此推测腰果梨酒对口腔炎症的治疗作用可能与腰果梨乙醇提取物的抑菌作用密切相关。

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Extraction of Antibacterial Materials from Cashew Apple

MIAO Zi-jian，LI Cong-fa，TANG Yan-ping，XIONG Hai-bo，HOU Yuan-yuan，LIU Si-xin*
(College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

Antibacterial materials were extracted from cashew apple and the inhibitory effect of the extract on different test strains was evaluated. Single-factor and central composite experiments were used to explore the optimal extraction processing parameters for antibacterial materials from yellow and red cashew apple using Staphylococcus aureus and Candida albicans as the indicators. The optimal extraction processing parameters for antibacterial materials from yellow cashew apple were ethanol concentration of 70%, extraction temperature of 85 ℃, material-liquid ratio of 1:13.9 and extraction time of 2.65 h; while the optimal extraction processing parameters for antibacterial materials from red cashew apple were ethanol concentration of 70%, extraction temperature of 85 ℃, material-liquid ratio of 1:14.5 and extraction time of 2.44 h. The extract obtained by optimal extraction processing from cashew apple exhibited an enhanced inhibitory effect on test bacterial strains.

cashew apple；antibacterial activity；extraction；central composite design

TS201.1

A

1002-6630(2010)24-0001-07

2010-09-13

“十一五”国家科技支撑计划课题(2007BAD76B04)；海口市高新技术产业发展专项(海科立[2009])；公益性行业(农业)科研专项(200903026)

苗子健(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为应用微生物技术。E-mail：miaozijian1100@sina.com

*通信作者：刘四新(1966—)，女，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：liusixin@21cn.com