羊乳中掺入牛乳的间接ELISA定量检测

薛海燕，胡围围，宋宏新,*，韩 燕，杨战月

(1.陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西 西安 710021；2.兴平市人民医院，陕西 兴平 713100)

羊乳中掺入牛乳的间接ELISA定量检测

薛海燕1，胡围围1，宋宏新1,*，韩 燕1，杨战月2

(1.陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西 西安 710021；2.兴平市人民医院，陕西 兴平 713100)

制备抗β-酪蛋白多克隆血清，免疫吸收封闭与羊乳反应的抗体，获免疫吸收抗体用于乳样的间接ELISA检测中，建立羊乳中掺入牛乳成分的定量免疫学方法。实验表明，该间接ELISA法用于原乳检测时，掺入牛乳的百分含量与A450nm在4%～50%呈线性关系，该方法的最低检出量为4%。所建立的ELISA方法变异系数＜5%，回收率在94%～105%之间，符合方法学要求，可用于牛乳掺假的定量检测。对灭菌乳的检测表明，热处理不改变β-酪蛋白与抗体反应的特性，方法还可用于经热加工的乳品检测中。

多克隆抗体；酶联免疫吸附反应(ELISA)；羊乳掺假；牛乳

羊乳及其制品风味佳易消化，牛乳过敏者饮用羊乳的不良反应较少[1]。我国奶羊养殖多以较小规模的农户散养为主，羊乳易受到季节波动影响，羊乳的市场价格比牛乳高，致使羊乳中掺入牛乳的现象时有发生[2]，这种掺假不仅在液态羊乳及其制品中，更多地会出现在原料乳的收购过程，急需建立一种适宜于现场快速检测羊乳掺入牛乳的方法，以确保羊乳制品质量和安全。目前报道用于羊乳的乳源性掺假的非免疫学方法包括气相色谱[3]、液相色谱、各种电泳(SDS-PADE、IEF、CF)和PCR[4]技术等，但这些方法难以在线检测。免疫学方法的特异性使其较多的用于乳源的区别检测中，常用的方法包括琼脂扩散试验、火箭免疫电泳、红细胞凝集抑制试验等，所需时间较长且抗血清浓度高；而酶联免疫吸附(ELISA)[5-7]方法特异性及灵敏度高，操作方便。本研究以牛乳中β-酪蛋白作为抗原产生多克隆抗体，并对抗体加以修饰，建立适合现场快速检测的羊乳中掺入牛乳含量的ELISA方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛乳与羊乳(西农萨能奶山羊乳) 西北农林科技大学畜牧试验场。辣根过氧化物酶联羊抗兔IgG 北京拜尔迪生物技术有限公司；β-酪蛋白标准品 Simga公司；其他试剂分析纯。

1.2 仪器与设备

MULTISKAN MK3酶标仪 Thermo Electron 公司；微量移液器 德国Eppendorf公司；YX-280型手提式压力蒸汽消毒器 江阴滨江医疗设备厂；AKTA purifier10蛋白纯化层析系统(DEAE-Sephadex A50离子交换色谱柱) GE Healthcare公司；酶标板 西安舟鼎国公司。

1.3 抗体的制备

用牛β-酪蛋白标准品免疫新西兰白兔。收集血清后采用饱和硫酸铵分级沉淀法分离[8]，再经过DEAESephadexA50离子交换色谱纯化，所得抗体与α-酪蛋白、κ-酪蛋白及乳清蛋白交叉反应小[9]。对多克隆抗体进行免疫吸收[10-12]可去除与羊乳β-酪蛋白交叉反应的抗体组分，即采用羊β-酪蛋白(2mg/L)与CNBr-活化的琼脂糖交联后，加入纯化的多克隆抗体中反应4h，清液即为较特异的抗牛β-酪蛋白多克隆抗体(简称修饰抗体)，用于牛羊乳的区别检测。

1.4 样品的检测方法研究

羊乳样品制备，鲜乳分别经62℃水浴30min得巴氏灭菌乳；121℃灭菌20min得高温灭菌乳；经80℃预热，板式换热器137℃条件下间接加热4s，得UHT灭菌乳。

用间接ELISA法检测羊乳样品中掺假牛乳成分。以乳样品为包被抗原，自制的抗牛β-酪蛋白多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗，测定在450nm波长处吸光度(A450nm)，考察ELISA检测结果。一抗和酶标记抗体的最佳稀释度经过方阵滴定法确定。

2 结果与分析

2.1 修饰抗体的特异性

将修饰抗体及非修饰抗体用于脱脂牛羊乳的间接ELISA检测中，修饰抗体1:80稀释，酶标二抗1:1600稀释，测定A450nm，结果如图1所示。

图1 未修饰抗体与修饰抗体检测牛乳、羊乳的间接ELISA曲线Fig.1 Indirect ELISA curves for the identification of bovine milk adulteration in goat milk using unmodified and modified antibodies

图1 显示未修饰抗体在采用间接ELISA检测牛乳和羊乳时，A450nm相似，难于区别两种奶样；而修饰抗体用于检测时，羊乳A450nm远远低于牛乳，可用于羊乳和牛乳样品的区别检测。经修饰后的β-酪蛋白多克隆抗体已经除去与可与羊乳中抗原反应的抗体，以下的间接ELISA反应均采用修饰后的多克隆抗体。

2.2 样品最适稀释度的选择

将脱脂牛乳以2n倍比稀释，以ELISA稀释液阴性对照，修饰抗体1:160稀释，酶标二抗1:1000，测定A450nm，结果见图2。

图2 不同脱脂牛乳包被稀释度与A450nm值的关系Fig.2 Relationship between the concentration of coated bovine milkand A450nm

从图2可以看出，脱脂牛乳稀释度的增加对A450nm影响并不是很大，当脱脂牛乳的稀释度在1:26时，A450nm为1.0以上，且P/N值相差最大。因此选择脱脂牛乳样品的包被稀释度为1:26。

2.3 间接ELISA方法在3种样品掺假检测中应用

将牛乳样品按梯度掺入羊乳样品后，经过不同方式处理，用建立的间接 ELISA 实验条件进行检测。各个浓度的标准样都设立3个平行孔，求出它们吸光度的均值。然后以掺入牛乳的百分含量为横坐标，以A450nm为纵坐标作图，得到掺入牛乳含量与A450nm的关系图。

2.3.1 脱脂羊乳掺假检测的间接ELISA结果

图3 脱脂羊乳中掺入牛乳体积分数与A450nm值关系图Fig.3 Relationship between A450nm and the concentration of bovine milk adulteration in goat milk

将脱脂牛乳按梯度0、2、5、10、20、30、40、50、70、100%体积分数掺入脱脂羊乳中作为待检样品，以建立的间接 ELISA方法检测，掺入牛乳含量与A450nm的关系如图3所示。

当脱脂羊乳中所掺入牛乳体积分数在50%以下时，A450nm与其呈线性关系，当掺入牛乳体积分数高于50%时，由于乳中蛋白质含量太高，在包被酶标板吸附时形成多层吸附，未直接吸附在酶标板上的蛋白在洗涤操作中被洗去，因此掺入的牛乳高于50%时，其吸光度几乎达到一个平台维持不变。低于50%时的回归方程为A450nm=0.196＋0.0186B，其中B代表掺入牛乳的体积分数，R2=0.999。因此，这一线性关系可以作为判断脱脂羊乳中掺入牛乳含量的标准曲线。在实际检测时，每批次的ELISA中都设一组孔做标准曲线。

2.3.2 灭菌羊乳掺假检测的间接ELISA结果

图4 牛羊乳混合灭菌后的间接ELISA检测结果Fig.4 Indirect ELISA detection results in milk mixture samples

实验初步研究受热处理后的乳品对间接ELISA的影响。将脱脂牛乳按相同梯度0～100%体积分数掺入羊乳中做不同热处理后作为待检样品，间接 ELISA检测结果如图4所示。羊乳中所掺入脱脂牛乳含量与A450nm的关系趋势与未热处理加工乳相似。即在掺入量大于50%后，检测所得A450nm几乎不再增加。

由此可知，在本实验中经过巴氏灭菌、高温灭菌及UHT灭菌乳的混合乳样品的免疫化学活性改变不大，也就是说热处理不影响吸附在酶标板上的牛乳β-酪蛋白的相应抗原表位。同时从ELISA稀释液替代羊乳的A450nm与混合乳相似可知，羊乳本底非常小，该ELISA可完全特异检测牛乳的存在。当羊乳中所掺入牛乳含量在5%～50%灭菌乳中，A450nm与掺入牛乳量呈线性关系。2.4羊乳中掺入牛乳成分检测的间接ELISA方法的评价指标

2.4.1 羊乳中掺入牛乳成分的最低检出量

在实验的最佳反应条件下，经3组平行重复实验检测混合样品中牛乳成分，按间接ELISA操作流程检测获得最小检出量。所得结果如表1。脱脂乳品的最低检出量为4%，接近国外采用哺乳动物抗血清免疫方法检出量[13-15]。

表1 羊乳中掺入脱脂牛乳含量敏感性实验平均值表Table 1 Sensitivity test for the indirect ELISA

2.4.2 羊乳中掺入牛乳成分检测的重复性及回收率实验

取不同混合量的样品包被酶标板，用己经建立的间接ELISA反应系统检测，测A450nm，每个样品6孔重复，计算变异系数(CV)。比较检验结果的重复性，结果如表2所示。

表2 脱脂乳的间接ELISA重复性实验Table 2 Reproducibility test for the indirect ELISA

从表2可以看出，板内检测羊乳中掺入牛乳成分的A450nm的变异系数(CV)小于5%，说明板内检测样品的重复性良好，系统稳定。所建立的间接ELISA检测羊乳中掺入牛乳成分含量具有良好的重复性。在同时重复性试验的同时，以已知掺入8%、15%、25%及35%的乳样品(重复3个平行)做回收率实验，发现回收率在94%～105%之间，所建立的ELISA能够在4%～50%之间满足定量检测的要求。当掺假超出50%时，乳样能够表现出味道或热性质的变化，或通过再稀释测得相应量，而小于4%的掺假量并不能获得较高利益，所以采用该方法建立的快速检测可用于防止羊牛乳样品的掺假。

3 结 论

通过对抗β-酪蛋白多克隆抗血清的免疫吸收，获得能够区别牛羊乳的多克隆抗体，建立了一种能够定量检测羊乳中牛乳成分的掺假的间接ELISA方法，检测线性范围为4%～50%，检测最低限为4%，本方法的灵敏度与国内外同类方法相近，低于PCR检测，但是该检测方法操作灵活，在现场乳品收购检测时可直接根据颜色反应判定是否掺假，在实验室中又可根据吸光度的测定，建立标准曲线，定量检测用于质量控制监督。研究羊鲜乳、酪蛋白及热加工处理的乳品掺入牛乳成分的检测，结果显示该ELISA均具有良好适用性。

[1]HAENLEIN G F W. Goat milk in human nutrition[J]. Small Ruminant Research, 2004, 511: 55-163.

[2]王坤, 叶兴乾, 关荣发. 羊乳及其奶酪中掺入牛乳检测的研究[J]. 食品与发酵工业, 2005, 31(10): 136-138.

[3]CHEN R K, CHANG L W, CHUNG Y Y, et al. Quantification of cow milk adulteration in goat milk using high-performance liquid chromatography with electrospray ionization mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2004, 18(10): 1167-1171.

[4]LOPEZ-CALLEJA I M, GONZALEZ I, FAJARDO V, et al. Application of an indirect ELISA and a PCR technique for detection of cow , s milk in sheep,s and goat ,, s milk cheeses[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(1): 87-93.

[5]ZELENAKOVA L, GOLIAN J, ZAIAC P. Application of ELISA tests for the detection of goat milk in sheep milk[J]. Milchwissenschaft, 2008, 63(2): 137-141.

[6]NICOLETA S N, GABRIELA R. Identification of adulterated sheep and goat cheeses marketed in Romania by immunochromatographic assay [J]. Food and Agricultural Immunology, 2010, 21(2): 157-164.

[7]HURLEY I P, COLEMAN R C, IRELAND H E, et al. Use of sandwich IgG ELISA for the detection and quantification of adulteration of milk and soft cheese[J]. International Dairy Journal, 2006, 16: 805-812.

[8]王廷华, 李官成, ZHOU Xinfu. 抗体理论与技术[M]. 北京: 科学出版社, 2005: 203-205.

[9]宋宏新, 韩燕, 孟静. 牛乳β-酪蛋白的ELISA检测[J]. 食品科技, 2008 (8): 213-215.

[10]GARCIA T, MARTIN, R, RODRIGUEZ, E, et al. Detection of bovine milk in ovine milk by an indirect enzyme-linked immunosorbent assay [J]. Journal of Dairy Science, 1990, 73(6): 1489-1493.

[11]RODRIGUEZ E, MARTIN R, GARCIA T. Indirect ELISA for detection of goats, milk in ewes , milk and cheese[J]. Journal of Dairy Science, 1991, 26: 457-465.

[12]MARKETA B, SNASELOVA J. Possibilities of different animal milk detection in milk and dairy products-a review[J]. Czech J Food Sci, 2005, 23: 41-50.

[13]EC Regulation No. 213/2001 of the Commission January 9(2001). Methods for the analysis and quality evaluation of milk and milk products [S]. Official Journal of the European Communities, 2001, L37: 1-99.

[14]HURLEY I P, IRELAND H E, ROBERT C. Application of immunological methods for the detection of species adulteration in dairy products [J]. International Journal of Food Science and Technology, 2004, 39: 873-878.

[15]GOLFOMOATSOU E A. Recent developments in antibody based analytical methods for the differentiation of milk from different species[J]. International Journal of Dairy Technology, 2003, 56(3): 133-138.

Indirect ELISA for Detection and Quantification of Bovine Milk in Goat Milk

XUE Hai-yan1，HU Wei-wei1，SONG Hong-xin1,*，HAN Yan1，YANG Z,han-yue2
(1. College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi an 710021, China；2. The People , s Hospital of Xingping, Xingping 713100, China)

An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed for the detection and quantification of bovine milk adulteration in goat milk. The polyclonal antibodies were modified by mixed them with goat milk for the assay. The absorbance at 450 nm in indirect ELISA revealed a linear relationship with the concentration of adulterated bovine milk at the range of 4%-50%. Detection limit was 4% for mixed milk samples. The assay was characteristics of high reproducibility with intra- and inter-assay variation coefficients less than 5%. The recovery rate of spiked samples was in the range of 94%-105%. Therefore, the ELISA can successfully use to determine the adulteration of milk samples, which is suitable for developing a kit in routine inspection of milk.

polyclonal antibody；ELISA；goat milk adulteration；bovine milk

Q51

A

1002-6630(2010)24-0370-04

2010-07-21

陕西省科学技术研究发展计划项目(2009K02-09)；陕西省教育厅产业化培育项目(09JC19)；陕西省教育厅自然科学专项(2010JK425)

薛海燕(1979—)，女，讲师，硕士，研究方向为食品免疫检测技术。E-mail：xuehaiyan@sust.edu.cn

*通信作者：宋宏新(1959—)，男，教授，硕士，研究方向为食品营养与安全。E-mail：songhx@sust.edu.cn