响应面分析法优化两相溶剂系统提取葛花异黄酮工艺

冯维希，张永丹，韩 婷，刘 莹，程 钢，黄 文,*

(1.江苏联合职业技术学院连云港中医药分院，江苏 连云港 222006；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉430070；3.中南民族大学生命科学学院，湖北 武汉 430078)

响应面分析法优化两相溶剂系统提取葛花异黄酮工艺

冯维希1，张永丹2，韩 婷2，刘 莹2，程 钢3，黄 文2,*

(1.江苏联合职业技术学院连云港中医药分院，江苏 连云港 222006；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉430070；3.中南民族大学生命科学学院，湖北 武汉 430078)

以葛花为原料，正丁醇-水两相系统为溶剂提取葛花总异黄酮。在单因素试验基础上，利用Box-Behnken中心组合试验和响应面分析法，对葛花总异黄酮提取工艺参数进行优化。结果表明：提取时间1.30h、提取温度70℃、正丁醇-水的配比1:1(V/V)、液固比55:1(mL/g)时，葛花总异黄酮的实际提取率为96.24%，预测值为97.50%，实验值与预测值相符，样品纯度可达73.89%。采用响应曲面法对葛花异黄酮提取条件进行优化合理可行。

两相溶剂系统；葛花；异黄酮；响应面法；提取工艺

葛花(Flos Puerariae)又名葛条花，为豆科植物野葛[Pueraria lobata(wild) Ohwi]的干燥花蕾，在我国主要分布于云南、广东、湖南及其临近省区，是我国传统医学中最具代表性的解酒药物，长期以来被用于缓解酒后呕吐等症状[1]。葛花中的异黄酮成分是其主要活性成分之一，药理研究表明，葛花异黄酮具有解酒保肝[2]、抗肿瘤[3]、抗炎镇痛[4]、抗氧化[5]及雌激素样作用[6]等活性。因此，对于葛花异黄酮提取工艺的研究具有重要的意义。

对于从植物原料中获得有效成分，在Dimitrov等[7]和Boyadzhiev等[8]提出的将固液浸取与液膜分离进行藕合的方法基础上，徐化能等[9]提出了葛藤异黄酮制备过程中用有机溶剂-水组成的两相溶剂系统代替常规的单相溶剂系统直接浸取，即浸取与液液萃取藕合的操作新模式。该方法的优点为在浸取的同时进行部分纯化，简化了工艺设备、降低了成本、减少了异黄酮在复杂操作流程中的损失。

本实验以葛花为原料，尝试以正丁醇-水两相系统为溶剂，采用响应曲面法的Box-Behnken模式，重点考察提取时间、提取温度、溶剂比、固液比对葛花总异黄酮提取率的影响，优化异黄酮的提取工艺参数，为葛花资源的深加工利用及葛花异黄酮的工业化生产提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

葛花：采于湖北恩施，晾干、密封置阴凉处保存，供实验用。经鉴定，葛花为豆科植物野葛的干燥花蕾。

葛根素标品(含量大于99%) 中国药品生物制品检定所；正丁醇、乙醇、甲醇、石油醚(30～60℃)均为分析纯。

UV-9100紫外分光光度计 北京瑞利分析仪器有限公司；751型石英比色皿(10mm) 江苏金坛市亿通电子有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器 常州国华电器有限公司；EyelaN-1000旋转蒸发仪 上海欣茂仪器有限公司。

互联网金融是传统行业与新兴行业的结合，具有互联网与金融两者的特征，展现出高风险特点。而财务风险本来是任何行业都需要面临的，但是随着互联网金融的诞生，其财务风险的起点就直接变得更高，使得许多相关企业的应对能力无法满足互联网金融发展的需要，极易致使企业的财务预期收益、实际收益等产生偏差的概率，在这种环境下，互联网金融的财务风险更多的就是缺乏对金融市场防范机制的构建，而且由于互联网的扩散性，任何不利于互联网金融市场的信息瞬间就会被扩散到金融消费者，极易使得整个金融市场受到影响，主要的表现在四个维度。

1.2 方法

1.2.1 葛花异黄酮提取工艺流程

葛花→粉碎→过筛(60目)→正丁醇-水加热提取(同时搅拌器搅拌)→过滤→两相分离→过滤→测定滤液中的总异黄酮含量→计算提取率

1.2.2 异黄酮含量测定

采用紫外分光光度法以葛根素为标准品制作标准曲线，得回归方程：y=54.236x＋0.0123，R2=0.9997。其中以总异黄酮的质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标。

1.2.3 葛花异黄酮提取率测定

精密称取5g葛花粉末3份，按1.2.1节方法制备样品溶液，再各分别精密吸取1mL置于100mL量瓶中，以70%乙醇定容至刻度。以70%乙醇作空白对照，在250nm处10mm石英比色杯测定吸光度，然后由标准曲线计算出待测液中异黄酮的含量。葛花粉末中异黄酮含量测定参考李文等[10]报道方法。

1.2.4 葛花总异黄酮提取的单因素试验

分别以不同的提取时间(20、30、60、90、120min)，提取温度(30、40、50、60、70℃)，正丁醇-水溶剂配比(1:3、1:2、1:1、2:1、3:1)及液固比[(30:1、40:1、50:1、60:1、70:1(mL/g)]为单因素，考察不同单因素对葛花异黄酮提取率的影响。

1.2.5 葛花总异黄酮提取工艺的响应面法优化试验

在单因素试验的基础上，确定Box-Behnken设计的自变量，以葛花总异黄酮提取得率为响应值，通过响应面分析进行提取条件的优化。因素水平设计见表1。

表1 工艺优化响应面试验因素水平设计Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.6 数据处理

采用Design Expert 6.0.5软件对结果进行分析。试验数据以“平均值±标准差”表示，采用t检验，显著性标准取P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

图1 提取时间对总异黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of total isoflavones

图2 提取温度对总异黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of total isoflavones

图3 正丁醇-水的溶剂配比对总异黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of n-butanol-water ratio on extraction rate of total isoflavones

图4 液固比对总异黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of total isoflavones

在单因素试验中，对提取时间、提取温度、正丁醇-水的比例和液固比分别进行考察，结果显示：随着提取时间的增加，葛花总异黄酮提取率也随之提高(图1)，但是时间超过1h后提取率的增加并不明显，提取时间为1h较适宜。如图2所示，随着提取温度升高，葛花总异黄酮的提取率明显增加，当温度超过60℃葛花总异黄酮的提取率变化趋于平缓，选择60℃为宜；改变提取溶剂比例，对总异黄酮提取率有着显著影响(图3)，当正丁醇-水的比例为1:1时，总异黄酮的提取率达到最高，之后随之下降，选择正丁醇-水的比例为1:1。随着提取液固比的增加，葛花总异黄酮的提取率也随之提高(图4)，当液固比超过50:1时，提取率提高并不显著，超过60:1后，提取率有所下降，因而本实验建议采用液固比50:1。综上所述，选取提取时间1h、提取温度60℃、正丁醇-水配比1:1以及液固比50:1为最佳条件。

2.2 响应曲面优化试验

2.2.1 响应曲面分析试验设计方案与结果

根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，结合单因素试验的结果，优化出29组试验，每次试验重复3次取平均值，结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及提取率的响应值和预测值Table 2 Design of Box-Behnken experiments and response values and predicted values of extraction rate of total isoflavones

2.2.2 模型的建立及其显著性检验

利用Design-Expert 6.0.5软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到二次多元回归方程：

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

一般而言，探索和优化的拟合响应曲面可能会产生不好或误导性的结果，除非该模型的拟合性很好，这使得检验的模型基本合适。二次多项式的方差分析显示该模型的P值小于0.0001(表3)，失拟项P=0.0545，不显著。说明该模型拟合结果好。

表4 回归模型系数显著性检验Table 4 Significance test of regression equation coefficients

系数的显著性P值检验见表4，如果F值越大，P值越小，相应的变量就越显著。参数最优化的系数评估显示所有的自变量和平方项显著的影响总异黄酮的提取率。分析还显示提取温度和正丁醇-水配比的交互影响是显著的(P＜0.0001)。

2.2.3 响应曲面分析

图6 不同浸取因素对总黄酮提取率的交互影响的响应曲面图Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction among different extraction factors on extraction rate of total isoflavones

植物的各种有效成分主要存在于细胞的内部——细胞质中，将细胞中有效成分浸出就必须设法穿越细胞壁和膜[11]。显然，有效成分浸出细胞壁和膜是受速度限制的。在提取效率的研究中传质速率的分析扮演着重要角色[12]。在本研究中随着提取时间(X1)的延长导致了总异黄酮提取率的增加，当提取时间(X1)达到某一水平(约1.25h)时，总异黄酮提取率达到最大值，此后没有显著进一步的提高(图6b)或者会有所下降(图6a和6c)。这可能是因为提取时间太短，异黄酮分子的溶解和扩散还没有达到平衡，仍旧保留在葛花固体原料中；提取时间太长，溶解的异黄酮分子长时间在光、氧和微生物的环境中可能导致异黄酮分子的氧化、降解。

随着液固比(X4)的增加，总异黄酮提取率将显著增加(图6e)，或者，当液固比(X4)达到某一水平(约为55左右)，总异黄酮提取率达到最大值，此后没有显著进一步的提高(图6c和6f)。这可能是因为增加液固比可能增加了溶剂到原材料细胞的扩散率并增加了异黄酮分子从细胞中的解吸附，当异黄酮分子溶解充分后时，再增加液固比将不会导致异黄酮提取率的增加。

当植物原料被浸泡在溶剂中，溶剂将帮助有效成分穿越细胞壁和细胞膜的阻力。不同的溶剂穿越阻力的能力是依溶剂性质来定的。不同的溶剂将具备不同的穿越能力，因此将导致不同的提取效果。本研究中当提取时间(X1)、提取温度(X2)和液固比(X4)分别为某一固定水平时，正丁醇-水的配比(X3)变成提高总异黄酮的临界因子，正丁醇-水的配比(X3)的波动可能导致总黄酮提取率的很大不同(图6b、6d、6f)。可以从图中看到，正丁醇-水的配比(X3)的最佳条件约为1:1(V/V)。

提高提取温度(X2)不仅能够使固体颗粒膨胀破裂，产生裂痕或微孔，从而加深已有的破损结构，而且能够改变溶剂的物理性质(表面张力、黏度等)，提高溶剂的渗透细胞壁和膜的能力。另一方面，提高温度能够加强浸取速率提高有效成分的扩散系数。因此，在本研究中很容易发现，随着提取温度(X2)的提高，异黄酮的提取率也随之增加(图6a、6e)。另外研究发现，提取温度(X2)在不同水平的正丁醇-水的配比(X3)，对异黄酮提取率的影响是不同的(图6d)。从图6d可以看到，在较低的正丁醇-水的配比(X3)水平阶段，响应曲面图的等高线曲线相对平滑，说明提取温度(X2)对总黄酮提取率的影响较小。然而，在高的正丁醇-水的配比(X3)水平阶段，响应曲面图的等高线显示提取温度(X2)的增加对总黄酮提取率有正向影响。这可能归因于高水平的正丁醇-水的配比(X3)有较高的黏度，只有在较高的温度下才能降低其黏度和表面张力，溶剂才能很容易的到达活性部位。

2.2.4 回归模型的验证实验

为了检验预测最佳响应值的方程(1)的可靠性，采用预测的条件进行异黄酮的提取：时间1.31h，温度69.5℃，正丁醇-水的配比1.03:1(V/V)，液固比56.42:1 (mL/g)，这时模型的预测最大值为97.50%。为了保证预测值不偏离实际值及实际操作的便利，将提取工艺参数修正为：提取时间1.30h，提取温度70℃，正丁醇-水的组成1:1(V/V)，液固比55:1(mL/g)。在此条件下重复提取3次，实际测得平均提取率为96.24%，与理论值相比，其相对误差约为1%左右，样品纯度可达73.89%。结果分析表明实测值和预测值高度一致，同时也说明模型方程(1)是令人满意的、准确的，优化得到的提取条件参数是准确可靠的，具有实用价值。

表5 优化条件下的实测值与预测值Table 5 Predicted and experimental values of extraction rate under the optimal extraction processing conditions

3 结 论

本实验研究了正丁醇-水两相溶剂系统提取葛花总异黄酮的工艺。正丁醇-水两相溶剂系统的单因素试验表明，最佳条件为提取时间1h、提取温度60℃、正丁醇-水配比1:1、液固比50:1。在单因素的基础上，采用四因素三水平的Box-Behnken设计，利用响应曲面法对影响葛花总异黄酮提取率的主要因素(提取时间，提取温度、正丁醇-水配比和液固比)进行研究，以葛花总异黄酮提取率为响应函数，建立相应数学模型：Y = -6.69431＋21.79401X1-0.29375X2＋68.13901X3＋1.87854X4-8.26784X12-47.35284X32-0.015407X42＋0.46750X2X3。优化了工艺条件：提取时间1.30h、提取温度70℃、正丁醇-水的配比1:1(V/V)、液固比55:1(mL/g)，此条件下葛花总异黄酮的提取率可高达96.24%，样品纯度可达73.89%。在该优化条件下，数学模型的预测值与试验观察值高度吻合，说明Box-Behnken设计法用于葛花总异黄酮的工艺优化筛选是可行的。本实验为葛花资源的深加工利用及葛花异黄酮的工业化生产提供了理论依据。

[1]MIAO H. The pharmacological action of compounds of isoflavone[J]. Foreign Med Sci-Sec Pharmacol, 1999, 16: 355-358.

[2]HAN YO, HAN M J, PARK S H, et al. Protective effects of kakkalide from flos puerariae on ethanol-induced lethality and hepatic injury are dependent on its biotransformation by human intestinal microflora[J]. Journal of Pharmacological Sciences, 2003, 93: 331-336.

[3]LEE H U, BAE E A, KIM D H. Hepatoprotective effects of tectoridin and tectorigenin on tert-buty hyperoxide-induced liver injury[J]. Journal of Pharmacological Sciences, 2005, 97: 541-544.

[4]FAG R, HOUGHTON P J, HYLANDS P J. Cytotoxic effects of compounds from Iris tectorum on human cancer cell lines[J]. J Ethnopham Acol, 2008, 118(2): 257-263.

[5]YOU K M, JONG H G, KIM H P. Inhibition of cyclooxygenase/ lipoxygenase from human platelets by polyhydroxylated /methoxylated flavonoids isolated from medicinal plants[J]. Arch Pharm Res, 1999, 22 (1): 18-24.

[6]KANG K A, ZHANG R, PIAO M J. Protective effect of irisolidone,a metabolite of kakkalide, against hydrogen peroxide induced cell damage via antioxidant effect[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 16: 1133-1141.

[7]DIMITROV K, METHEVA D, BOYADZHIEV L. Integrated process of extraction and 1iquid membrane isolation of atropine from Atropa belladonna roots[J]. Separation and Purification Technology, 2005, 46: 41-45.

[8]BOYADZHIEV L, DIMITROV K, METCHEVA D. Integration of solvent extraction and 1iquid membrane separation: an efficient tool for recovery of bioactive substances from botanicals[J]. Chemical Engineering Science, 2006, 61: 4126-4128.

[9]徐化能. 葛藤异黄酮的浸取与分离过程研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2007.

[10]李文, 贺殿, 王晓, 等. 葛花中总黄酮的含量测定[J]. 西北药学杂志, 2005, 20(1): 14-15.

[11]陈玉昆. 中药提取生产工艺学[M]. 沈阳: 辽宁出版社, 1992: 40-41.

[12]BARTLE K D, BODDINGTON T, CLIFFORD A A, et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for the determination of oligomers in poly (ethylene terephthalate) films[J]. Analytical Chemistry, 1991, 63 (20): 2371-2377.

Optimization of Two-phase Solvent System Extraction Processing for Isoflavone from Flos puerariae by Response Surface Methodology

FENG Wei-xi1，ZHANG Yong-dan2，HAN Ting2，LIU Ying2，CHENG Gang3，HUANG Wen2,*
(1. Lianyungang TCM Branch of Jiangsu Union Technical Institute, Lianyungang 222006, China；2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；3. College of Life Science, South Central University for Nationalities, Wuhan 430078, China)

Flos puerariae was used as raw material to extract isoflavone using n-buatnol/water two-phase system as solvents. Based on single factor experiments, the optimal extraction processing was explored by central design composite experiments combined with response surface methodology. Results showed that the optimal extraction processing parameters were extraction time of 1.3 h, extraction temperature of 70 ℃, n-buatnol-water ratio of 1:1 (V/V) and material-liquid ratio of 1:55 (g/mL). Under these optimal conditions, the extraction rate of isoflavone was 96.24%, which was very close to predicted value. Therefore, it is feasible to optimize the extraction processing of isoflavone from Flos puerariae by response surface methodology.

two-phase system；Flos puerariae；isoflavone；response surface methodology；extraction

R284.2

A

1002-6630(2010)24-0177-05

2010-06-07

生物资源保护与利用湖北省重点实验室基金项目(2007009)

冯维希(1961—)，女，副教授，学士，主要从事中药化学研究。E-mail：fengweixi@sina.com

*通信作者：黄文(1968—)，女，副教授，博士，主要从事天然产物化学研究。E-mail：huangwen@mail.hzau.edu.cn