谷物中伏马菌素B1酶联免疫分析法的建立

刘师文，何庆华，邹 龙，许 杨*

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，中德联合研究院，江西 南昌 330047)

谷物中伏马菌素B1酶联免疫分析法的建立

刘师文，何庆华，邹 龙，许 杨*

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，中德联合研究院，江西 南昌 330047)

以匙孔血蓝蛋白(KLH)为载体，采用碳化亚二胺法人工合成伏马菌素B1(FB1)抗原FB1-KLH，免疫大白兔获得特异性良好的抗FB1多克隆抗体；在多克隆抗体的基础上建立伏马菌素B1的间接竞争酶联免疫吸附分析方法，该方法IC50为11.7μg/L，最低检出限1.1μg/L，平均批内和批间变异系数分别为5.8%、10.2%；分析不同溶剂对标准曲线和加标回收率的影响，确定PBS溶液为样本最佳提取溶剂；在玉米、小麦、大米、高粱谷物样本中添加50～500μg/kg的FB1标准品，平均回收率在70.5%～105.6%之间。将该方法应用于40份谷物样本中FB1的检测，检测结果与高效液相色谱的相关系数(R2)为0.9547。该方法简单、灵敏、快速、准确，适用于谷物中FB1的检测。

伏马菌素B1；酶联免疫分析(ELISA)；谷物

伏马菌素主要是由镰刀菌Fusarium moniliforme和F.proliferatum产生的一类结构类似的真菌毒素，常见于玉米、高粱和大米等谷物及及其制品中[1]。其中FB1在自然污染的玉米中约占伏马菌素总量的70%[2]，是造成污染的主要成分，也是导致伏马菌素毒性作用的主要原因。它能引起马脑脊髓白质病、猪肺水肿、多种动物肝和肾细胞死亡以及再生性损害[3]，以及啮齿类动物肝癌、肾癌[4]等。流行病学调查显示人类食管癌与伏马菌素污染有关[5]。国际癌症研究中心将FB1归为2B类致癌物质[6]。

伏马菌素分布广泛且毒性较大，越来越受到人们的关注。美国食品药品监督管理局(FDA)公布的食用谷物中伏马菌素的推荐最高限量为2mg/kg[7]；欧盟公布不同饲料中伏马菌素的推荐最高限量标准为5mg/kg[8]。

加强FB1残留的检测是控制危害发生的重要手段。目前，粮食和饲料中FB1的检测方法多采用高效液相色谱法[9-11]和免疫检测法[12-13]。前者的灵敏度和特异性较高，样品处理一般采用固相萃取或免疫亲和层析，检测时需对FB1进行衍生化，样品前处理过程复杂，成本较高。而在抗原抗体反应基础上建立的免疫检测法的样品处理简单、灵敏度高、特异性强，检测速度快，能实现大量样品的同时的检测。本研究成功合成了FB1的

人工抗原，制备了抗FB1特异性兔多克隆抗体，在多克隆抗体的基础上建立了谷物中FB1灵敏快速的酶联免疫分析法，对促进FB1检测技术的发展，控制FB1危害发生具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

伏马菌素B1、伏马菌素B2、黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、碳化亚二胺盐酸盐(EDC.HCl)、吗啡啉乙磺酸(MES)、弗氏完全佐剂和不完全佐剂 Sigma公司；鸡卵清蛋白(OVA) 上海生工生物技术服务有限公司；96孔可拆酶标版 美国康宁公司；其他试剂纯度均为分析纯或更高纯度。

酶标仪 Thermo公司；超纯水仪 Millipore公司；HPLC荧光检测器 Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 抗FB1兔多克隆抗体的制备和鉴定

1.2.1.1 抗原合成

采用碳化亚二胺法合成人工抗原，参照文献[14]并有所改进，具体如下：

免疫抗原(FB1-KLH)：1mg FB1溶于0.5mL MES偶联缓冲液(MES 21.3mg，NaCl 52.65mg， NaN32mg，蒸馏水定容至10mL)后与2.5mg KLH(溶于0.5mL超纯水)混合，加入0.1mL 10mg/mL的新鲜配制的 EDC溶液。25℃搅拌反应2h，静置30min，4℃，PBS(0.01mol/L，pH7.4)透析，分装于－20℃冻存。

检测抗原(FB1-OVA)：1mg FB1溶于0.5mL MES偶联缓冲液，称取5mg OVA溶于1mL超纯水，两者混合，加入0.2mL 10mg/mL的新鲜配制的EDC溶液。25℃搅拌反应2h，静置30min，4℃，PBS透析，分装于－20℃冻存。

1.2.1.2 多克隆抗体的制备

按500μg/只的剂量免疫两只2kg左右的大白兔，首免时采用弗氏完全佐剂和等体积的免疫抗原混合后背部皮下多点注射(多于30个点)，饲养于标准实验兔房。首免后间隔4周加强免疫。加强免疫后第7天，耳缘静脉采血，间接ELISA检测血清的效价，三免后从实验兔腿动脉取全血。

抗血清采用辛酸-饱和硫酸法粗提，将粗提后获得的抗体小剂量分装至－20℃冻存。选取效价和灵敏度较高的兔抗体进行ELISA试验。

1.2.1.3 抗体的效价

A、将检测抗原FB1-OVA用PBS稀释至2.4μg/mL，100μL/孔包被96孔酶标板，放入湿饭盒中4℃过夜；B、倾去包被液，PBST洗涤3次，拍干，每孔加入300 μL 5%的脱脂牛奶(溶于超纯水)，37℃保湿封闭1h；C、倾去封闭液，PBST满孔洗涤3次；D、加入经PBS倍比稀释的抗血清和阴性血清，同时设置阳性对照和空白对照(以PBS代替抗体)，每孔100μL，37℃保湿30min；E、PBST洗涤4次。每孔加100μL 1:1000的羊抗兔IgGHRP，37℃保湿30min；F、PBST洗涤3次，每孔加TMB底物液100μL，37℃保湿避光反应5min；G、每孔50μL 2mol/L H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm波长处的吸光度。以抗血清的吸光度至少两倍于阴性血清的吸光度的最大稀释倍数作为抗体效价(S＞2.1N)。1.2.1.4抗体特异性鉴定

A、酶标板的包被和封闭与1.2.1.3节中的A～C相同；B、取包被封闭好的板条，加入经PBS稀释的50μL抗血清和50μL质量浓度为125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9、0ng/mL溶于PBS的FB1竞争抗原[FB1、黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤酶烯酮(ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和FB2]混匀。37℃温育30min；C.其余步骤与1.2.1.3节的E～G相同。

根据各加入的竞争抗原(FB1)的浓度制作竞争抑制曲线。

1.2.2 酶联免疫分析法的建立

1.2.2.1 检测抗原和多克隆抗体工作浓度的确定

将检测抗原用PBS稀释至0.6、1.2、2.4、4.8μg/mL、抗FB1多克隆抗体分别进行2000至12.8万倍倍比稀释，进行方阵滴定，确定ELISA检测抗原包被浓度和抗体工作浓度。

1.2.2.2 标准曲线的建立

采用PBS将FB1检测抗原稀释至1.2μg/mL包被酶标板。PBS将FB1标品溶液稀释至0.5～1000μg/L系列标准浓度，每个质量浓度重复3次，取OD450平均值计算结合率绘制抑制曲线。ELISA步骤参照文献[15]。

包被7个批次的板条，每个4次重复绘制标准曲线，计算平均批间和批内变异系数。

1.2.3 甲醇和乙腈体积分数对ELISA影响

分别用含体积分数5%、10%、20%、40%甲醇和乙腈的PBS进行ELISA试验，根据标准曲线的变化确定其对ELISA的影响。

1.2.4 不同提取液对加标回收的影响

称取粉碎的玉米样品(经HPLC检测为FB1阴性)1g，加入FB1标准品，加标量为500μg/kg，分别加5mL蒸馏水、PBS、75%甲醇-水(V/V)、50%乙腈-水(V/V)，

充分振荡15min，4000×g离心10min，上清经PBS稀释10倍后进行ELISA检测。每种提取液重复提取3次，ELISA检测时重复两次(n=6)。

1.2.5 谷物样本加标回收率的测定

将FB1加到1g粉碎的谷物样本(玉米、小麦、大米)，样本均经HPLC检测为FB1阴性，每种样品加标3个质量浓度，分别为50、200、500μg/kg，每个加标质量浓度重复3次，加入5mL提取溶液(由1.2.3节中的方法确定的溶液)充分振荡15min，4000×g离心10min，取上清液进行ELISA测定，计算加标回收率。

1.2.640 份谷物样本中FB1的检测

采用建立的ELISA方法检测40份谷物样本，样品提取方法参照1.2.4节方法，同时采用HPLC方法对照。

HPLC条件：流动相，甲醇-0.1mol/L NaH2PO4(85: 15，V/V)，加磷酸调pH3.35，流速0.9mL/min，荧光检测，激发波长335nm，放射波长440nm。样品经强阴离子交换柱预处理后，临苯二甲醛(OPA)衍生1min，取20μL进样。

2 结果与分析

2.1 抗FB1多克隆抗体的制备和鉴定

2.1.1 抗体的效价

图1 抗体效价测试Fig.1 Determination of antibody titer

每次加强免疫后的第7天对兔进行耳缘静脉采血，采用间接非竞争ELISA监测兔抗血清效价变化，两只实验兔的效价相当。图1例举了其中一只兔抗体效价测试结果。由图可见，抗体效价达128000。

2.1.2 抗体的特异性

采用间接竞争ELISA分析兔多克隆抗体与AFB1、OTA、DON、ZEN与FB1、FB2交叉反应，抑制曲线见图2。由图可见，抗体能识别FB1与FB2，不能识别AFB1、OTA、DON、ZEN与FB1、FB2的交叉反应率(CR)分别为100%、75%[CR=100×IC50(FB1)÷IC50(参试毒素)]，与其他4种真菌毒素未见交叉反应。

图2 抗体与常见真菌毒素的交叉反应Fig.2 Cross-reactivity between antibodies and common mycotoxins

2.2 酶联免疫分析方法的确立

2.2.1 检测抗原浓度和抗体工作浓度

采用间接非竞争ELISA，方正滴定确定最佳抗原包被、抗体工作浓度，方阵滴定结果见表1，确定检测抗原包被质量浓度为1.2μg/mL，抗体工作浓度为1: 8000。

表1 抗原质量浓度和抗体稀释度方正滴定Table 1 Detection of indirect ELISA

2.2.2 间接竞争ELISA标准曲线

采用1.2μg/mL 检测抗原包被浓度和1:8000兔多抗工作浓度建立FB1间接竞争ELISA标准曲线，结果见图3，标准曲线线性回归方程为Y=－16.705lnX+91.059(R2= 0.9921)，IC50为11.7μg/L，最低检出限1.1μg/L(IC10)。

图3 FB1间接竞争ELISA抑制曲线Fig.3 Indirect ELISA inhibition curve of FB1

7个批次的板条绘制的标准曲线平均批间变异系数为10.2%，平均批内变异系数为 5.7%，该方法的重复性良好。

2.3 甲醇、乙腈体积分数对ELISA抑制曲线的影响

研究5%～40%的甲醇和乙腈对ELISA的影响，结果见图4。由图可知，不同体积分数的甲醇和乙腈对ELISA抑制曲线都有影响，随着两种有机溶剂体积分数的升高，IC50值增大，曲线的线性也发生改变。10%以内的甲醇、乙腈对ELISA的影响相对较小。因此做加标回收实验时，样品粗提液应该用PBS将有机溶剂体积分数稀释至10%以内进行ELISA检测。

图4 有机溶剂体积分数对ELISA抑制曲线的影响Fig.4 Effect of organic solvent volume on indirect ELISA inhibition curve linearity of FB1

2.4 不同提取液对加标回收的影响

在经HPLC检测的FB1阴性玉米样品中加入FB1标准品，最终加入量为500μg/kg，分别采用PBS、蒸馏水、75%甲醇-水、50%乙腈-水作提取液，粗提液经PBS稀释10倍后ELISA检测，结果见表2。由表可见，4种提取液对加标回收率的影响有很大的区别，其中75%的甲醇-水回收率较低，为51.1%；用50%乙腈-水提取的回收率为141.7%，易造成假阳性。采用PBS溶液提取的回收率为95.5%，因而选取PBS做为最佳提取液。

表2 不同提取液加标回收结果(n=6)Table 2 Effect of extraction solvent type on spike recovery rate of FB1 (n=6)

2.5 谷物样本中加标回收率

采用PBS做提取溶液，对玉米、小麦、大米、高粱样本做加标回收实验，结果见表3。由表可见，在玉米、小麦、大米、高粱样本中，加标50、200、500μg/kg的FB1标准品，平均加标回收率分别为89.7%、70.5%、98.6%、105.6%。

表3 谷物样本中加标回收结果(n=6)Table 3 Recovery rates of FB1in cereal samples spiked at different levels (n=6)

2.6 谷物样本中FB1含量的ELISA检测结果

表4 40份谷物样品中FB1的ELISA和HPLC检测结果Table 4 FB1concentrations in 40 cereal samples determined by this method and HPLC

采用建立的ELISA方法筛查了40份谷物样本，同

时使用HPLC方法检测。ELISA结果显示，在40份样本中有28份样本被FB1污染，检出率为70%，在阳性样本中FB1含量为35.1～6774.8μg/kg。HPLC结果显示，在40份样本中有26份样本被FB1污染，检出率为65%，在阳性样本中FB1含量为24.9～3266.5μg/kg。经统计分析，两种方法的结果相关性良好，YELISA=1.6226XHPLC+ 2.547(R2=0.9547)。

3 讨 论

抗原合成中载体，合成的方法，佐剂的种类以及免疫的剂量，以及免疫的方式的都是影响抗体FB1抗体特异性以及亲和力的因素[12,14,16]。在这些报道的文献中FB1与载体KLH偶联获得的抗体特异性最好，效价最高[17]，因此本研究采用KLH作为载体制备免疫抗原。两只实验兔经过抗原免疫后都获得了抗FB1的抗体，抗体的效价达128000。

FB1易溶于水、甲醇、乙腈等溶剂，有文献报道了采用50%乙腈-水(V/V)[18]75%甲醇-水(V/V)[13]做提取溶剂，本研究发现不同体积分数的甲醇和乙腈对ELISA抑制曲线都有影响，75%的甲醇-水回收率不理想，而50%乙腈-水采用这种溶剂可能造成假阳性，本实验中采用PBS溶液做提取液回收率较理想，而且安全环保。

4 结 论

采用碳化亚二胺法，以KLH为载体制备了FB1人工抗原免疫大白兔后获得了特异性抗体，抗体效价达128000，在多克隆抗体的基础上建立了间接竞争ELISA方法，该方法IC50为11.7μg/L，最低检出限1.1μg/L，批内变异系数5.8%，批间变异系数10.2%。将建立的方法运用于40份谷物样本中FB1含量的检测，检测结果与HPLC方法结果的相关系数(R2)为0.9547。该方法灵敏快速、操作方便、准确，适用于谷物中FB1的检测。

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Development of an ELISA Method for Determining Fumonisin B1in Cereals

LIU Shi-wen，HE Qing-hua，ZOU Long，XU Yang*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Sino-Germany Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Polyclonal antibodies against fumonisin B1were produced in rabbits with FB1/keyhole limpet hemocyanin conjugate. A sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determining FB1was developed. The concentration of FB1causing 50% inhibition of binding enzyme marker (IC50) was 11.7μg/L and the detection limit was 1.1μg/L. The average variation coefficients in intragroup and intergroup were 5.8% and 10.2%, respectively. PBS was selected as the best extract solvent through extensive investigations. The recovery rates from corn, wheat, rice and sorghum samples spiked at a level varying from 50 to 500μg/kg ranged from 70.5% to105.6%. The contents of FB1in 40 cereal samples were screened by the developed ELISA method and the results exhibited a positive correlation with the results from HPLC (R2= 0.9547). This method is sensitive, fast and accurate and therefore is suitable for screening the presence of FB1 in cereals.

fumonisin B1；ELISA；cereal

TS207.3

A

1002-6630(2010)18-0350-05

2010-05-05

国家“863”计划项目(2007AA10Z427)

刘师文(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为分子免疫学。E-mail：luishiwen985@126.com

*通信作者：许杨(1951—)，女，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：xuyang1951@163.com