牦牛乳软质干酪成熟期挥发性风味成分分析

牛 婕，甘伯中,*，乔海军，刘兴龙

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州 730070；3.甘肃华羚生物科技有限公司，甘肃 兰州 730000)

牦牛乳软质干酪成熟期挥发性风味成分分析

牛 婕1，甘伯中1,*，乔海军2，刘兴龙3

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州 730070；3.甘肃华羚生物科技有限公司，甘肃 兰州 730000)

采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)对不同成熟时期(30、60、90d)牦牛乳软质干酪挥发性风味物质进行分离鉴定，共检测出45种化合物，并用峰面积归一化法确定各种化合物的相对百分含量。通过对固相微萃取纤维头和萃取温度的筛选优化实验条件，采用75μm CAR/PDMS(碳分子筛-聚二甲基硅氧烷)萃取纤维头，50℃条件下吸附不同成熟时期(30、60、90d)干酪的挥发性风味物质效果较好。检测出的挥发性风味物质主要是酸类、醇类、酮类，其次为酯类和醛类化合物，酸类物质构成了牦牛乳软质干酪的主体特征风味。乙酸、丁酸、己酸成为干酪中的优势风味物质。

牦牛乳软质干酪；风味物质；固相微萃取(SPME)；气相色谱-质谱法(GC-MS)

牦牛乳软质干酪是以牦牛乳为原料，经凝乳并分离出乳清而制得的发酵成熟的产品，是一种营养丰富、成熟时间短(一般为3个月)且具有独特风味的食品。牦牛乳中蛋白质(5.00%～5.32%)、乳脂肪(6.5%～7.5%)及干物质(17.31%～18.40%)含量均高于荷斯坦牛乳，且凝乳性好，牦牛乳干酪的出品率和营养价值均高于荷斯坦乳[1-2]。

干酪的香味主要来自于其中挥发性的酮、酸、醛、酯等风味组分[3]，其产生不仅仅是由单一的化合物组成，而是由多种芳香物质综合作用的结果[4]，因此选择合适的研究分析方法来鉴别特征风味物质的组成是干酪质量评价的重要指标。干酪挥发性风味物质的分析十分复杂，样品的预处理方法对分析结果影响很大。一般对食品样品进行前处理的传统方法主要包括蒸馏法、萃取法、吸附法等，固相微萃法(solid phase microextraction，SPME)集试样预处理和进样于一体，此方法具有不需任何溶剂，操作简便，可提高分析速度等优点，目前已广泛应用于食品风味物质的分析检测。国外采用SPME法对干酪风味的研究成果较多[5]，而国内目前仅见有张国农等[3]、李文钊等[6]、衣宇佳[7]采用SPME法对再制干酪和国产干酪风味进行了初步研究，

对牦牛乳干酪的风味研究尚未报道。

本实验以牦牛乳软质干酪为原料，采用固相微萃法对其挥发性风味物质进行提取，并利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用对产生的挥发性风味物质进行检测，为分析国产干酪的风味组分提供较适合的前处理和分析方法，为评价牦牛乳软质干酪的风味提供科学依据，为进一步合理开发利用青藏高原牦牛乳资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牦牛乳软质干酪(成熟期30、60、90d) 自制；无水硫酸钠、氯化钠(均为分析纯) 天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

SPME手动进样手柄、萃取纤维头(65μm PDMS/ DVB，聚二甲基硅氧烷-聚二乙烯基苯)、75μm CAR/ PDMS(碳分子筛-聚二甲基硅氧烷)、85μm PA(聚丙烯酸酯) 美国Supelco公司；6890-5973N气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；AL104型电子天平(精确至0.1mg) 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛乳软质干酪加工工艺流程

原料乳预处理(63℃低温巴氏杀菌30min)→冷却(32℃)→添加发酵剂→保温→添加CaCl2和凝乳酶(按酶活添加)→凝乳切割(切成不大于1cm3的凝块)→搅拌→排出乳清→真空包装→成熟(分别于5、10、15℃条件下贮藏)

1.3.2 萃取纤维头的筛选

准确称取牦牛乳软质干酪样品3份各20g，每份样品加入无水硫酸钠10g，氯化钠1g混合研磨均匀后置于50mL顶空进样瓶中，于30℃水浴加热平衡15min后，分别将65μm PDMS/DVB、75μm CAR/PDMS、85μm PA萃取纤维头插入3个顶空瓶中顶空吸附40min(30℃恒温吸附)，随后从样品瓶上拔出萃取头，再将萃取头插入气相色谱仪推出纤维头于250℃解吸5min，同时启动气相色谱仪采集数据。

1.3.3 萃取温度的筛选

准确称取牦牛乳软质干酪样品3份各20g，每份样品加入无水硫酸钠10g，氯化钠1g混合研磨均匀后置于50mL顶空进样瓶中，分别于30、40、50℃水浴加热平衡15min后，将75μm CAR/PDMS萃取纤维头插入顶空瓶中顶空吸附40min(分别于30、40、50℃恒温吸附)，随后从样品瓶上拔出萃取头，再将萃取头插入气相色谱仪推出纤维头于250℃解吸5min，同时启动气相色谱仪采集数据。

1.4GC-MS分析条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：OV1701 石英毛细柱(30m×0.25mm，0.50μm)；载气(He)流速1mL/min；不分流进样；升温程序：50℃保持1min，以5℃/min升温至220℃，保持10min；进样口温度：250℃。

1.4.2 质谱条件

电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度：250℃；离子源温度：230℃；质量扫描范围m/z 15～550。

1.5 数据处理

实验数据处理由MSD chemstation软件系统完成，化合物经计算机检索同时与NIST MS Search 2.0标准谱库相匹配检索定性，仅当正反匹配度均大于800(最大值为1000)的鉴定结果才予以报道。按峰面积归一化法计算化合物的相对含量。

2 结果与分析

2.1 顶空固相微萃取条件的优化

2.1.1SPME萃取头的筛选

不同固定相所构成的萃取纤维头涂层对各种化合物的萃取效果不同，纤维头的选择是决定干酪中挥发性风味物质分析的关键。在SPME过程中，涂层对待测样品基质存在竞争吸附，根据“相似相溶”原理，分析不同极性的待测物要用不同极性的高分子涂层进行萃取，才可达到对待测物的最大萃取量。本实验对65μm PDMS/DVB(聚二甲基硅氧烷-聚二乙烯基苯)，75μm CAR/PDMS(碳分子筛-聚二甲基硅氧烷)，85μm PA(聚丙烯酸酯)3种纤维头做了吸附筛选实验，以有效色谱峰个数和总峰面积作为选择指标。在相同的吸附(30℃水浴加热吸附40min)和解吸条件(250℃解吸5min)下将3种纤维头对干酪样品中挥发性风味物质的萃取效果进行比较，不同类型的SPME纤维头萃取效果存在较明显的差异(表1)。

表1 不同萃取纤维头对挥发性物质的萃取效果Table 1 Effect of extraction fiber on extraction efficiency

由表1可看出，65μm PDMS/DVB的总峰面积为1.08×1010，有效峰数为22个；75μm CAR/PDMS的总峰面积为6.15×109，有效峰数为25个；85μm PA的总峰面积为4.38×109，有效峰数为5个。65μm PDMS/ DVB的总峰面积较大但有效峰个数较少，85μm PA的总峰面积和有效峰数都是最低的，通过NIST MS Search

2.0标准谱库的检索与资料分析，采用75μm CAR/PDMS萃取效果较好，且有效峰数最多。

2.1.2SPME萃取温度的筛选

在顶空固相微萃取分析中，当样品为固态时，温度是影响萃取速度和效率的重要因素。在一定范围内，升高温度，一方面试样分子运动的速度加快，挥发性物质挥发速度加快，固体试样的分析组分能够尽快从试样中释放出来，增加蒸汽压，提高灵敏度；另一方面分配系数(K)会随之下降，挥发性物质在基体中溶解度会增加，可缩短平衡时间[8]。但温度过高会使挥发性物质分解，丧失定量的准确性。当萃取温度超过60℃时，易发生某些化学变化，例如萃取头固有组分的解吸等，从而降低萃取头吸附待分析组分的能力[7]。考虑到挥发性物质的沸点和分解温度，本实验采用75μm CAR/ PDMS萃取纤维头，固定其他条件，选择30、40、50℃3个萃取温度考查SPME萃取效果(表2)。

表2 不同萃取温度对萃取效果的影响Table 2 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

由表2可看出，萃取温度在30℃时检测到的总峰面积为4.94×108比40℃检测到的总峰面积4.72×108略大，但检测到化合物数量较少，有效峰数为25个，杂质出峰较多，这是由于温度低不利于风味物质的挥发。随着温度的提高，40℃时所吸附的化合物数量较30℃有所增加，有效峰数为28个，但总峰面积略有减少。当温度继续提高到50℃时，顶空各物质浓度增大，所吸附的化合物的数量和总峰面积均有明显的增加，有效峰数为28个，总峰面积为5.79×108。本实验选择50℃为最佳的萃取温度，且对有效峰数没有影响。

2.2 挥发性风味物质GC-MS分析

利用SPME纤维头吸附不同成熟时期(30、60、90d)牦牛乳软质干酪中的挥发性风味物质，GC-MS进行检测，牦牛乳软质干酪样品挥发性风味物质的总离子流图，如图1所示。

图1 不同成熟时期牦牛乳软质干酪中挥发性风味物质总离子流,图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile flavor compounds in yak s milk soft cheese during different ripening

干酪中挥发性风味物质的定量按峰面积归一化法计算其相对百分含量。挥发性风味物质分析根据GC-MS所得质谱信息经计算机用NIST MS Search 2.0标准质谱数据库检索，确认了其45种化合物，检测出干酪样品中主要挥发性风味化合物分别为酸类、醇类、酮类、酯类、醛类，各物质及相对百分含量如表3所示。

表3 GC-MS分离鉴定牦牛乳软质干酪的挥发性风味化合物Table 3 Isolation and,identification of volatile flavor compounds in yak s milk soft cheese by GC-MS

续表1

2.2.1 酸类化合物

由表3可见，牦牛乳软质干酪的挥发性风味组分主要为酸、醇、酮、酯4类物质，这4类化合物对干酪的风味具有重要影响。牦牛乳中脂肪含量一般高于荷斯坦牛乳，乳密度高[9]，因此制作的干酪脂肪含量较高，在不同成熟期(30、60、90d)水解产生的脂肪酸类物质的相对百分含量均居于各类挥发性化合物首位。干酪成熟第30d时，检测到3种酸类化合物，分别是乙酸、丁酸和己酸，3种酸占化合物总量的15.84%；干酪成熟第60d时，检测到7种酸类化合物，又生成少量丙酸、异丁酸、异戊酸和辛酸，其含量与成熟30d比较显著增加，占化合物总量的49.72%；成熟第90d时，总酸含量减少到26.40%，说明干酪成熟过程中凝块中残存的乳酸菌释放的胞外脂肪酶和乳酸菌自溶产生的胞内脂肪酶共同将干酪水解成为游离脂肪酸，使总酸含量在第30～60d显著增加，而到成熟后期，脂肪酸经过一系列生化反应进一步转变为甲基酮或自动氧化为醛类[10]，导致酸类化合物总量有所下降。

短链脂肪酸(C4～C12)的生成，具有某些显著的特征气味，而这些气味对于形成干酪的风味和气味是非常重要的。其中丁酸(酪酸)是最重要、最明显的风味化合物，意大利干酪中含量很高。丁酸可赋予干酪奶油气味，但当杂菌在发酵中增多时会引起丁酸产量增多而产生酸败气味[10]。干酪中丙酸不是由乳脂肪降解而来的，它是由微生物利用乳糖代谢产生的，略带辛辣的刺激油味，瑞士干酪中含量非常高；己酸多存在于赛达干酪、蓝纹干酪中，具有轻微的腐臭干酪样气味；辛酸有微弱的水果酸气味，淡酸味。本实验中检测到酸类物质含量居各类化合物总量的首位，构成了牦牛乳软质干酪的主体特征气味。乙酸、丁酸、己酸等成为干酪中特殊的优势风味物质。

2.2.2 醇类化合物

醇类物质有12种，含量比较高。醇类化合物一般沸点低、极性小，而本实验采用的75μm CAR/PDMS (碳分子筛-聚二甲基硅氧烷)是中等极性涂层的纤维头，因此对醇类化合物的吸附能力较强，萃取的醇类化合物种类和数量较多，但醇类化合物的风味阈值较高，对干酪整体风味的贡献较小。醇的形成与干酪制作过程中乳酸、氨基酸和脂肪酸有关，大部分来自脂肪氧化，是由脂肪酶对干酪中脂肪酸的降解作用产生的[11]，也有研究者认为是甲基酮被微生物还原后生成的[9]。少量醇是由于干酪蛋白水解酶和发酵剂蛋白酶等对蛋白质的降解作用所产生的羰基化合物还原生成的，这与Guillén等[12]的研究结果一致。糠醇(呋喃甲醇)具有甜香、焦糖香；异戊醇具有醇香、香蕉香。

2.2.3 酮类化合物

干酪成熟第30d与第60d的酮类化合物相对含量分别为3.54%和3.70%，成熟第90d时，其相对含量为4.59%。酮类化合物主要是由多不饱和脂肪酸的氧化或热降解、氨基酸降解或微生物代谢所产生的；酯质在受热情况下水解，生成甘油和游离脂肪酸，游离脂肪酸进一步发生β-氧化、脱羧作用后产生甲基酮[13-14]。本实验中干酪贮藏温度较低为10℃，在第30～60d期间部分甲基酮在微生物作用下分解为其他物质，当成熟第90d时，由于干酪中脂肪酸含量显著降低，在这期间部分脂肪酸在微生物作用下转变为甲基酮，使甲基酮含量有所增加，干酪香气更浓郁。在鉴定出的4种酮类物质中，其中2-庚酮是由亚油酸氧化产生，在各个成熟期中相对含量都较高，赋予牦牛乳软质干酪奶油气味，是干酪风味物质中的主要组成成分，也是其他品种如切达、青纹干酪具有的独特风味物质。2-丁酮、2-戊酮

具有果香、甜味，轻微的乳样香气；2-壬酮具有乳酪、奶香，是青纹、赛达、切达等干酪所具有的独特风味物质[15]。

2.2.4 酯类化合物

酯类化合物共6种，其中有5种是乙酯类化合物，成熟第30、60、90d的相对百分含量分别为2.89%、4.17%、2.78%，含量较低。乙酯类化合物是由乙醇和干酪中的脂肪酸反应产生，当酯类浓度超过某一范围时，干酪会呈现果实香气，有时也会导致干酪的风味劣化，故干酪中的水果味可以认为是由于乙醇或它的前体物过量产生的[16]，因此在干酪制作过程中应控制酯类物质的含量。乙酸乙酯具有有甜、果香、冰淇淋的香气；丁酸乙酯有甜果香；己酸乙酯有菠萝、果香、蜡香、香蕉香；辛酸乙酯有水果香和椰子香味。

2.2.5 醛类化合物

醛类物质有4种，含量较低。醛类物质的风味阈值一般是最低的，在食品中起重要作用并且是各种氧化风味的来源[1]。本实验中醛类物质检出种类和相对百分含量都很低，这可能与纤维头的吸附能力有关；综合考虑分析物的极性和挥发性，可能对这类物质的萃取效果不佳，影响了分析结果。苯甲醛是由色氨酸或苯丙氨酸转化而来的，对干酪整体良好风味的形成有重要作用[17]，呈苦杏仁香味和焦味，有果香、坚果香韵；壬醛能表现出新鲜味。

2.2.6 烃类及其他类化合物

烃类化合物种类繁多，也是普遍存在于干酪之中的一类化合物，包括直链烷烃和支链烯烃等。本实验检测出的烷烃主要是一些短链直链烷烃。由于烃类化合物的芳香阈值较高，不具有风味活性，所以对干酪的整体风味贡献较小[18]。实验中检测到的苯酚、甲苯在干酪中生成刺激性气味，对干酪风味产生了一定影响。

通过NIST MS Search 2.0标准谱库的检索与资料分析，SPME法对低沸点、高挥发性物质组分的分离比较有利，如对短链羧酸、醇、酯、酮类物质有较好的检出效果，检出以上物质在干酪样品中含量较高。此外，SPME法将萃取、脱附、进样结合在一起，不使用任何有机溶剂、所需样品量少、纤维头不与试样基体接触，从而避免了基体干扰，可提高分析速度，但同时也存在一些问题：对样品中高沸点、低挥发性组分萃取效果不佳，如检测到的长链羧酸和醛类物质种类和含量都较少，影响分析结果。

3 结 论

本实验对SPME的萃取纤维头和萃取温度进行优化，实验结果表明采用75μm CAR/PDMS(碳分子筛-聚二甲基硅氧烷)纤维头在50℃水浴加热条件下对牦牛乳软质干酪样品的挥发性风味物质萃取效果较好。利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术分别在成熟30、60、90d的干酪样品中检测出31、36、37挥发性风味物质，共计45种化合物，其中26化合物相同。从不同成熟时期的干酪样品中共检测出酸类化合物7种，酮类4种，醇类12种，酯类6种，醛类4种，其余为短链烷烃类、杂环类等物质。挥发性风味物质成分主要是酸类、醇类、酮类，其次为酯类和醛类化合物，其次为酯类和醛类。从挥发性成分的角度分析可知，酸类化合物由于其相对百分含量最高，构成了牦牛乳软质干酪的主体特征气味。乙酸、丁酸、己酸在成熟30、60、90d的干酪样品中保持较高的含量，成为干酪中的优势风味物质。

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Analysis of Volatile Compounds in Yak , s Milk Soft Cheese during Ripening

NIU Jie1，GAN Bo-zhong1,*，QIAO Hai-jun2，LIU Xing-long3
(1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China；2. College of Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China；3. Gansu Hualing Biotechnology Co. Ltd., Lanzhou 730000, China)

The flavor components in different ripening periods (30, 60 d and 90 d) in yak , s milk soft cheese were extracted by solid phase micro-extraction (SPME) and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis. A total of 45 compounds were detected and relative contents of these compounds were determined by peak area normalization method. The conditions of SPME were optimized to be 75μm CAR/PDMS and temperature of 50 ℃. The major volatile flavor compounds in yak s milk soft, cheese were acids, alcohols and ketones. Esters and aldehydes were also detected as the volatile flavor components. Acidic compounds were the major flavor components of yak , s milk soft cheese, among which, acetic acid, butyric acid, caproic acid and 2-heptanone were the most predominant compounds.

yak , s milk soft cheese；flavor component；solid phase micro-extraction (SPME)；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS207.3

A

1002-6630(2010)18-0278-05

2009-12-20

教育部科学技术研究重点项目(210225)；甘肃省高等学校研究生导师科研项目(1002-12)

牛婕(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为乳品科学与技术。E-mail：niujie-nj@163.com

*通信作者：甘伯中(1969—)，男，教授，博士，研究方向为乳品科学与技术。E-mail：ganbz@126.com