石榴花色苷的微波辅助提取及抗氧化活性研究

李巨秀，王仕钰，房红娟，张小宁

(西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

石榴花色苷的微波辅助提取及抗氧化活性研究

李巨秀，王仕钰，房红娟，张小宁

(西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

以陕西临潼甜石榴为试验材料，通过正交试验，采用pH差示法测定石榴总花色苷含量，优化微波辅助提取石榴花色苷的工艺参数。同时，采用DPPH法、FRAP法、ABTS法、螯合亚铁能力法分析石榴花色苷的体外抗氧化活性。结果表明：微波辅助提取石榴花色苷的最佳工艺参数为溶剂pH1、料液比1:13(g/mL)、提取时间210s、乙醇体积分数70%、微波输出功率360W。此条件下，花色苷得率为184.81μg/g。微波输出功率对石榴汁花色苷的提取得率有显著影响(P＜0.05)。石榴花色苷含量与DPPH自由基清除率、铁还原力、ABTS+自由基清除率和螯合亚铁离子有显著的相关性(相关系数R2分别为0.9928、0.9925、0.9913、0.9945)，呈明显的量效关系，IC50值分别为2.44、1.14、4.08、101.05mg/L。

微波辅助提取；石榴；花色苷；抗氧化活性

石榴是石榴科石榴属(Punica granatum L.)石榴的果实，原产于以伊朗为主的中亚国家[1-3]。我国主要产区为山东、安徽、陕西、河南、云南和新疆[4]。近几年，石榴的消费量逐年增长，主要原因是石榴中含有丰富的保健功能成分，其组分主要是以花色苷、单宁、鞣花酸为主的多酚类化合物[5-7]。已有研究表明，石榴具有抗癌、抗动脉粥样硬化、消炎、抗氧化等功能，在食品、医药领域具有广泛的应用前景等[8-11]。Richard等[12]的研究结果还表明石榴汁对老年性痴呆症具有一定的治疗作用，而Bianca等[13]认为石榴汁能抑制泡沫细胞的形成和动脉粥样硬化斑块的形成，降低细胞中低密度脂蛋白的氧化和胆固醇的合成。石榴中花色苷主要组分是矢车菊糖苷、飞燕草糖苷和天竺葵糖苷[7]。本研究利用微波辅助技术，分析乙醇体积分数、pH值、料液比、微波功率、提取时间对花色苷提取得率的影响，优化出石榴花色苷提取的适宜工艺参数，并采用4种方法分析石榴花色苷的抗氧化活性，为石榴保健功能的评价和产品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴：市售陕西临潼出产的甜石榴，挑选表皮干净无伤的石榴储藏于0℃冷库中备用。

试剂：无水乙醇、盐酸、氯化钾、硼酸、无水乙酸钠、冰醋酸等(所有试剂均为分析纯)；TPTZ(2.4.6-Tri(2-pyridyl)- s-triazine) 美国Sigma Aldrich Fluka公司；Trolox(水溶性VE) 美国Cayman化学试剂公司；ABTS [2,2＇-联氮-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)]、啡咯嗪[5,6-联苯基-3-(2-吡啶基)-1,2,4-三吖嗪，99%]、DPPH· (二苯代苦味酰基自由基，1,1-dipheny,1-2-picrylhydrazyl)美国Sigma公司；EDTA标品(乙二胺四乙酸二钠盐) 西安化学制剂厂。

1.2 仪器与设备

WD900B格兰仕微波炉(实验装置是在普通微波炉基础上改装而成，具体装置见图1) 顺德市格兰仕电器实业有限公司；UV-1700紫外分光光度计 日本岛津公司；SC-3610低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；PHS-3C型pH计 上海雷磁仪器厂；RE-201D旋转蒸发仪 巩义市予华仪器有限责任公司；AG135分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

图1 微波辅助提取石榴花色苷装置图Fig.1 Schematic diagram for the microwave-assisted extraction of anthocyanins from sweet pomegranate fruits

1.3 方法

1.3.1 微波辅助提取石榴花色苷的优化试验

在单因素试验基础上，选用L16(45)正交试验设计表，以溶剂pH值(A)、料液比(B)、提取时间(C)、乙醇体积分数(D)、提取功率(E)为影响因素，以花色苷含量为评价指标，优化提取的各项工艺参数，以筛选出最佳的提取工艺条件和工艺参数。因素水平安排如表1所示。所有组合进行两次平行试验。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.3.2 石榴花色苷的抗氧化活性分析

1.3.2.1 石榴花色苷清除DPPH自由基效果

参照文献[14]，略作改动。

(1) Trolox标准曲线的制作

准确称取Trolox 5.006mg，室温放置30min，蒸馏水溶解后，定容至100mL，得到浓度为200μmol/L Trolox标准贮备液，用蒸馏水稀释成20～160μmol/L的标准溶液，分别取1mL标准溶液与4.5mL 100μmol/L的DPPH甲醇溶液(准确称取7.856mg DPPH，用甲醇定容至200mL)充分混合，在室温下放置30min，于517nm波长处测吸光度(A试验)。对照组用4.5mL无水甲醇代替DPPH溶液(A对照)，空白组为1mL蒸馏水代替样品(A空白)，各组平行3次测定，按式(1)计算Trolox对DPPH自由基清除率。

以Trolox浓度为横坐标、清除率为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为y=0.4188x－0.6915(R2=0.9942)。

(2) 样品测定

取适量经旋转蒸发浓缩的石榴花色苷提取物，稀释不同倍数，按照标准曲线制作方法测定样品清除DPPH自由基的清除率，计算其IC50值。

1.3.2.2 石榴花色苷的铁还原力[15]

(1) 标准曲线的制作

用蒸馏水将200μmol/L Trolox标准溶液分别稀释成20～160μmol/L的系列标准溶液，分别取1mL Trolox标准系列溶液与4.5mL TPTZ工作液(由30mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液、10mmol/L TPTZ溶液、20mmol/L FeCl3溶液按体积比为10:1:1混合配制而得；10mmol/L TPTZ溶液：准确称取TPTZ 0.3123g，用40mmol/L HCl溶液溶解并定容到100mL)充分混合，室温下放置30min，于593nm波长处测吸光度(A试验)。对照组以4.5mL蒸馏水代替TPTZ工作液(A对照)，空白组以1mL蒸馏水代替样品液(A空白)，各组平行3次。按式(2)计算Trolox的铁还原力。

以Trolox浓度为横坐标、铁还原力为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为y=0.0074x+0.0111，相关

系数R2=0.9977。

(2) 样品的测定

将旋转蒸发浓缩的石榴花色苷提取液稀释至适宜的浓度梯度，各取1mL样品液按照标准曲线制作方法测定样品的铁还原力，计算IC50值。

1.3.2.3 石榴花色苷对ABTS+自由基的清除效果[16]

(1) 标准曲线的制作

用蒸馏水将200μmol/L Trolox标准溶液分别稀释成40～160μmol/L的系列标准溶液，各取1mL标准溶液与4.5mL ABTS+自由基工作液(10mL 7mmol/L的ABTS溶液与5mL 7.35mmol/L K2S2O8溶液混合后在室温下避光放置16h形成ABTS+自由基储备液，使用前用无水乙醇稀释成工作液，在734nm波长处的吸光度为0.70±0.02。充分混合均匀，室温放置6min，于波长734nm处测吸光度(A试验)。对照组以4.5mL无水乙醇代替ABTS+自由基工作液(A对照)，空白组以1mL蒸馏水代替样品液(A空白)，各组均进行3次平行测定。按式(3)计算ABTS+自由基的清除率。

以Trolox浓度为横坐标、ABTS+自由基清除率为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：y=0.4277x－2.5834，相关系数R2=0.9933。

(2) 样品的测定

取石榴花色苷浓缩液稀释成适当梯度的样品液，取1mL样品液与4.5mL ABTS+工作液混合，按照标准曲线制作方法测定样品清除ABTS+自由基的能力，计算IC50值。1.3.2.4石榴花色苷螯合亚铁能力测定[17]

(1) EDTA标准曲线的制作

用蒸馏水将0.1g/L EDTA标准储备液(准确称取0.1g EDTA标品溶于蒸馏水后，定容至1L，制成0.1g/L EDTA标准储备液)分别稀释成0.01～0.08g/L的系列标准溶液。各取1mL系列标准溶液，加入3.7mL甲醇，振荡混匀后，加入0.1mL 2mmol/L FeCl2，30s后再加入0.2mL 5mmol/L啡咯嗪，避光反应10min，4℃离心10min，取上清液，于562nm波长处测吸光度(A试验)。对照组以0.3mL蒸馏水代替0.1mL 2mmol/L FeCl2和0.2mL 5mmol/L啡咯嗪，空白组以1mL蒸馏水代替样品液。各组均平行测定3次，用式(4)计算EDTA螯合亚铁离子百分数。

以EDTA标准溶液浓度为横坐标、螯合亚铁离子百分数为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，y=898.17x+ 6.6368，相关系数R2=0.9945。

(2) 样品的测定

取石榴花色苷浓缩提取液，稀释成适宜的梯度样品液，取1mL样品液按照标准曲线的制作测定吸光度，根据标准曲线计算IC50值。

1.3.3 石榴花色苷的测定方法

参照文献[18]，采用pH差示法测定石榴花色苷含量，即利用在pH1的缓冲溶液中和pH4.5的缓冲溶液中510nm和700nm波长处吸光度的差值，最后换算成以矢车菊-3-葡萄糖苷为主的总花色苷的含量。

1.3.4IC50值

IC50值表示当自由基清除率为50%或吸光度为0.5时的样品浓度。

1.4 数据分析

用DPS 7.55统计软件和Excel 2003分析实验数据。

2 结果与分析

2.1 微波辅助提取石榴花色苷的优化试验

在单因素试验基础上，选用L16(45)正交试验设计表，对影响石榴汁花色苷提取的各参数进行优化，得到试验结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design layout and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variances for anthocyanin yield with various extraction conditions

由表2可知，五个因素对花色苷提取得率的影响的主次顺序为E＞C＞A＞D＞B，即微波输出功率＞提取时间＞溶剂pH值＞乙醇体积分数＞料液比。试验所得到的最佳优化工艺组合为A1B4C3D3E3，即溶剂pH1、料液比1:13(g/mL)、提取时间210s、乙醇体积分数70%、微波输出功率360W。

由表3方差分析结果可知，溶剂pH、料液比、提取时间、乙醇体积分数、微波输出功率五个因素中只有微波输出功率对石榴汁花色苷的提取得率表现出显著影响(P＜0.05)。

由于得到的优化组合不在此正交试验设计表内，故以该优化组合的参数进行了2次重复验证实验，经计算花色苷得率为184.81μg/g，证明该最佳工艺条件比较理想。

2.2 石榴花色苷的体外抗氧化活性

2.2.1 石榴花色苷清除DPPH自由基效果

二苯基苦基苯肼(DPPH自由基)是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能清除它则表明受试物具有清除羟自由基、烷自由基或过氧自由基的能力，从而中断脂质过氧化链反应[19]。

不同含量花色苷样品清除DPPH自由基得到的结果见图2 。

图2 石榴花色苷对DPPH自由基的清除效果Fig.2 Concentration dependent DPPH scavenging effect of anthocyanins from sweet pomegranate fruits

由图2可知，石榴花色苷含量在0.74～3.70mg/L的范围内，对DPPH自由基的清除率范围为6%～68%，相当于Trolox浓度为49.26～171.15μmol/L，花色苷含量与DPPH自由基清除率呈现显著的正相关性(R2=0.9928)，其IC50值为2.44mg/L，表明石榴汁花色苷对DPPH自由基有较强的清除效果。

2.2.2 石榴花色苷的铁还原力

Benzie和Strain建立的FRAP法原理明确，操作简便，不需特殊仪器，易于标准化，已用于测定不同抗氧化物质、食物与生物样品的抗氧化活性，它反映样品的总还原能力，可用来反映样品总抗氧化活性[20]。石榴花色苷铁还原力分析结果见图3。

图3 石榴花色苷的还原力Fig.3 Concentration dependent ferric reducing antioxidant power of anthocyanins from sweet pomegranate fruits

由图3可知，石榴花色苷含量在0.15～1.48mg/L范围内，还原力为0.15～1.17，花色苷含量与还原力呈现之间有显著量效关系(R2=0.9925)，相当于Trolox的浓度为11.31～81.76μmol/L。石榴花色苷还原力的IC50值为1.14mg/L，表明石榴汁花色苷的还原能力较强。

2.2.3 石榴花色苷清除ABTS+自由基的效果

抗氧化剂清除ABTS+自由基可作为评价抗氧化剂的总抗氧化能力。石榴花色苷清除ABTS自由基的结果见图4。

图4 石榴花色苷对ABTS自由基的清除率Fig.4 Concentration dependent ABTS+radical scavenging effect of anthocyanins from sweet pomegranate fruits

从图4可看出，当石榴花色苷含量在0.66～6.55mg/L范围内，对ABTS+自由基的清除率为13.5%～73.9%，两者间有显著的正相关性，其线性回归方程为y=10.084x+8.8786，R2=0.9913，相当于Trolox浓度为37.69178.85μmol/L。石榴花色苷清除ABTS+自由基的

IC50值为4.08mg/L。

2.2.4 石榴花色苷的亚铁螯合力

亚铁离子是脂质过氧化反应的催化剂，其不仅加速自由基的产生，产生活性氧，缩短脂肪氧化的诱导期，同时加速氢过氧化物的分解，加剧脂质氧化反应。石榴花色苷螯合亚铁的结果见图5。

图5 石榴花色苷的亚铁离子螯合能力Fig.5 Concentration dependent ferrous ion chelating capacity of anthocyanins from sweet pomegranate fruits

由图5可知，石榴花色苷含量在26.22～131.09mg/L范围时，其螯合亚铁离子的能力为16.7%～67.3%，两者间有明显的量效关系，相关系数R2为0.9945，相当于EDTA的质量浓度为0～66.31mg/L。石榴花色苷螯合亚铁离子的IC50值为101.05mg/L，表明石榴花色苷具有一定的金属螯合能力。

3 结 论

波辅助提取法具有节省溶剂、提取时间短、提取含量高、操作方便等优点。石榴花色苷具有清除自由基的能力，且花色苷浓度与其抗氧化活性有一定的量效关系。

3.1 微波辅助提取石榴花色苷的最佳提取工艺参数为提取溶剂的pH1、料液比1:13(g/mL)、提取时间210s、乙醇体积分数70%、微波输出功率360W。在此条件下得到的花色苷提取率为184.81μg/g。试验因素对石榴花色苷提取得率的影响顺序为微波输出功率＞提取时间＞溶剂pH＞乙醇浓度＞料液比，其中微波输出功率对提取得率有显著的影响(P＜0.05)，其他因素的影响均不显著。

3.2 石榴汁花色苷清除DPPH自由基的IC50为2.44mg/L，当石榴汁花色苷含量在0.74～3.70mg/L时，相当于Trolox浓度为49.26～171.15μmol/L。石榴汁花色苷铁还原力的IC50为1.14mg/L，当石榴汁花色苷含量在0.15～1.48mg/L时，其铁还原力相对应的Trolox浓度为11.31～81.76 μmol/L。石榴汁花色苷清除ABTS+自由基的IC50为4.08mg/L，当石榴汁花色苷含量在0.66～6.55mg/L时，相当于Trolox浓度为37.69～178.85μmol/L。石榴汁花色苷螯合亚铁能力的IC50值为101.05mg/L，当石榴汁花色苷含量在26.22～131.09mg/L时，相当于EDTA质量浓度为0～66.31mg/L。

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Microwave-assisted Extraction and Antioxidant Activity Evaluation of Anthocyanins from Pomegranate (Punica granatum L.) Fruits

LI Ju-xiu，WANG Shi-yu，FANG Hong-juan，ZHANG Xiao-ning
(College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Pomegranate (Punica granatum L.) fruit is rich in anthocyanins, which has attracted great attention for its health benefits. The aim of this study was to optimize five parameters for the microwave-assisted extraction of anthocyanins from sweet pomegranate fruits from Lintong region, Shaanxi province and to evaluate the in vitro antioxidant activity of the extracted anthocyanins by DPPH radical scavenging, ferric reducing antioxidant power (FRAP), 2,2＇-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical cation (ABTS+) and ferrous ion chelating assays. The optimal extraction parameters of anthocyanins were as follows: pH value 1; solid/liquid ratio 1:13; length of extraction time 210 s; microwave power 360 W; and ethanol concentration 70%. An anthocyanin yield of 184.81μg/g was achieved under these conditions. Microwave power had a significant effect on anthocyanin yield (P ＜ 0.05). The extracted anthocyanins had the ability to scavenge DPPH and ABTS+radicals, ferric reducing antioxidant power and ferrous ion chelating capacity in a linear concentration-dependent manner, with corresponding correlation coefficients (R2) of 0.9928, 0.9925, 0.9913 and 0.9945, and the IC50values were 2.44, 1.14, 4.08 mg/L and 101.05 mg/L, respectively.

microwave assistance；pomegranate；anthocyanin；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-6630(2010)18-0165-05

2010-06-23

李巨秀(1972—)，女，副教授，博士，研究方向为食品化学。E-mail：juxiuli@msn.com