复合酶法提取红蘑多糖工艺

李书倩，张 博，辛 广，于 洋，刘长江*

(1.鞍山师范学院化学系，辽宁 鞍山 114007；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161)

复合酶法提取红蘑多糖工艺

李书倩1,2，张 博1，辛 广1，于 洋1，刘长江2,*

(1.鞍山师范学院化学系，辽宁 鞍山 114007；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161)

以野生红蘑为原料，复合酶法浸提红蘑中真菌多糖。在单因素试验的基础上，采用正交试验设计获得最佳多糖提取工艺，即酶解温度60℃、纤维素酶和木瓜蛋白酶的比例为3:1(m/m)、pH5.0、酶解3h，此条件下提取多糖得率为12.0%。与传统方法相比，该工艺具有提取条件温和，提取时间较短，对多糖损伤小等特点。

红蘑；多糖；提取；复合酶

红蘑(Gomphidius rutilus)，学名血红铆钉菇，具有较高的食用和药用价值，无任何毒性，其药用价值主要体现在真菌多糖的生物活性上，尚未实现人工培育[1]。真菌多糖在国际上被称为“生物反应调节剂”[2]，它能控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老[3]，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒[4]、促进核酸和蛋白质的生物合成、修复损伤的组织细胞等多种功效，极具医疗和食用价值[5-6]，在生物学、医学、药物学、食品科学等领域受到广泛关注。因而，如何能从红蘑中最大限度地提取多糖，且不破坏多糖的生物活性，对保持细胞健康，延长细胞寿命，从而实现人体健康有重要的意义[7-8]。

食用菌多糖的提取工艺近年来研究很多，但有关红蘑多糖的提取工艺的研究还未见报道[9]。传统工艺有热水浸提法、酸提法、碱提法等，新兴工艺包括酶提法、超声波辅助法、微波辅助浸提法等[10]。其中热水浸提法是最为经典的方法，以工艺简单，易于推广等特点为人们所接受，但其提取率较低[11-12]；酸提和碱提都易破坏真菌多糖的生物活性[13]；超声波辅助法和微波辅助浸提法都只是一种辅助的提取方法[14]。相对而言，酶法的提取工艺比较温和[15]。因此，本研究通过采用复合酶法破壁，对野生红蘑中粗多糖提取工艺进行优化，从而得出最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生红蘑 市购，烘干、粉碎过40目筛备用。

纤维素酶(酶活力1.0×106～2.0×106U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力1.0×105～2.0×106U/g)为生化试剂 北京奥博星生物技术有限责任公司；无水乙醇、氢氧化钠、丙酮、苯酚、石油醚、浓硫酸、浓盐酸(均为分析纯)。

1.2 仪器与设备

FZ102型微型植物粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；SHB-B95型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；RE-52旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；DZF型真空干燥箱 北京市永光明医疗仪器厂；DELTA320pH酸度剂、PL2002电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 红磨多糖提取工艺[14-15]

工艺流程：野生红蘑→烘干至质量恒定→粉碎→称量→酶解→灭酶→减压抽滤→浓缩→滤液醇析→减压抽滤→沉淀物→洗涤→烘干→粗多糖制品。

操作要点：称取2g红蘑干粉，按1:40(g/mL)的料液比加入蒸馏水，加入体积分数0.3%的复合酶液在一定温度和pH值下酶解一定时间，升温灭酶1.5h，进行减压抽滤，得到的滤液减压浓缩至1/3体积，加入3倍体积的无水乙醇，静置24h，依次用乙醇、丙酮、乙醚洗涤多糖除去部分的脂肪和蛋白质，50℃条件下干燥多糖，称量。

1.3.2 多糖测定

用干重法计算粗多糖的质量，用苯酚-硫酸法检测多糖含量确定多糖纯度[16-18]。

1.3.3 多糖提取的单因素试验[19]

红蘑中的多糖与蛋白质结合于细胞中，用纤维素酶处理可以破碎细胞的细胞壁，木瓜蛋白酶可以破坏多糖与蛋白质的结合力，使多糖易于从细胞中释放出来。选取复合酶比例按质量比4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、酶解温度(50、55、60、65℃)、酶解时间(1、2、3、4h)及pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)这4个因素考察各因素对红蘑多糖得率的影响。

1.3.4 多糖提取的正交试验

在单因素的基础上进行正交试验L9(34)设计，优化提取工艺。

1.3.5 统计分析

采用极差法进行结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 复合酶比例对多糖得率的影响

分别验证纤维素酶和木瓜蛋白酶的最适质量分数，其结果均为0.3%，故设定复合酶的质量分数为0.3%。改变纤维素酶与木瓜蛋白酶的质量配比，即4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，在60℃，正常pH值条件下，酶解2h，测定粗多糖含量，选出最佳区间，结果见图1。

图1 复合酶比例对多糖得率的影响Fig.1 Effect of cellulase/papain mass ratio on polysaccharide yield

由图1可知，多糖的得率取决于纤维素酶的含量，纤维素酶含量下降，则粗多糖的得率也随之下降，这可能是由于纤维素酶含量下降，酶与底物接触机会减少，破壁效果减弱，不利于多糖从细胞中释放出来。而木瓜蛋白酶主要使多糖与结合的蛋白分开，提高多糖的得率，但与蛋白结合的多糖未从细胞中溶出，则不利于木瓜蛋白酶作用的发挥。如果继续增加纤维素比例(4:1)，则多糖得率增加不明显，考虑成本等因素，选择纤维素酶与木瓜蛋白酶比例3:1、2:1、1:1进行正交试验设计。

2.1.2 复合酶温度对多糖得率的影响

分别验证纤维素酶和木瓜蛋白酶的有效温度，试验表明，纤维素酶的有效温度为45～65℃，木瓜蛋白酶的有效温度为50～90℃，故选取复合酶的温度为50～65℃，即在纤维素酶与木瓜蛋白酶比例为3:1，正常pH值，复合酶温度为50、55、60、65℃的条件下酶解2h，测定粗多糖含量，选出最佳区间，结果见图2。

图2 复合酶温度对多糖得率的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on polysaccharide yield

由图2可知，随着温度的升高，粗多糖的得率不断增高，当温度升高到60℃后，温度的升高反而会降

低粗多糖的得率。这是因为温度升高，反应物的能量增大，使反应速率加快，超过其最适温度后，酶活减弱，所以反应速度会随着温度的升高迅速下降，故选择作用温度50、55、60℃进行正交试验设计。

2.1.3 酶解时间对多糖提取率的影响

其他条件不变，分别采用1、2、3、4h提取红蘑多糖，测定粗多糖含量，选出最佳区间，结果见图3。

图3 酶解时间对多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on polysaccharide yield

由图3可知，随着酶解时间的延长，粗多糖得率也不断上升，但时间达到3h后粗多糖的得率会随着时间的延长而下降，这可能是因为酶解时间过长，会导致部分多糖结构破坏，使粗多糖的得率下降。因此在3h周围选择作用温度2.5、3、3.5h进行正交试验设计。

2.1.4 复合酶最适pH值的确定

其他反应条件不变，分别在pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲溶液中进行反应，以pH值为横坐标，粗多糖得率为纵坐标作图，选出最佳区间，结果见图4。

图4 复合酶pH值对多糖得率的影响Fig.4 Effect of pH on polysaccharide yield

由图4可知，复合酶的最适pH区间为4.0～6.0，以5.0为最好，这是因为pH值可改变能影响酶分子活性部位上有关基团的解离。在最适pH值时，酶分子上活性基团的解离状态最适于与底物结合。pH值高于或低于最适pH值时，活性基团的解离状态发生改变，酶和底物的结合力降低，因而酶反应速度降低。因此，在pH5.0周围选择pH4.5、5.0、5.5进行正交试验设计。

2.2 正交试验

2.2.1 试验设计

在单因素试验的基础上进行正交试验，优化提取工艺。选择酶解时间、酶解温度、纤维素酶与木瓜蛋白酶的比例和pH值4个对多糖提取影响较大的因素，设计L9(34)的正交试验，因素水平编码如表1所示。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

2.2.2 试验结果与分析

L9(34)正交试验结果如表2如示，通过极差分析，复合酶法提取红蘑中的粗多糖最优条件预测为A2B3C1D2，即酶解3h、酶解温度60℃、纤维素酶和木瓜蛋白酶的质量比为3:1、pH5.0。

表2 L9(34)正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

2.2.3 验证实验

表3 最佳工艺验证实验Table 3 Verification of optimal extraction conditions

采用优化工艺提取红蘑多糖，即酶解3h、酶解温度60℃、纤维素酶和木瓜蛋白酶的比例为3:1、pH5.0

的条件下进行验证实验，结果见表3，粗多糖得率为12.0%，比正交试验中各处理的结果都高，证明正交试验优化结果有效。采用苯酚-硫酸法测定粗多糖中多糖含量，得其纯度为78.17%。

3 讨论与结论

为了保证多糖提取率，同时避免样品处理间的环境误差，采用1:40(g/mL)的料液比提取红蘑中的多糖，但对于提取液进行浓缩时会耗时耗能，所以在进行后续的中试时还需进一步优化料液比，以期提高工业生产效率。采用纤维素酶与蛋白酶提取红蘑多糖，在提取过程中不可避免的增加红蘑中蛋白质的总含量，但在后续的多糖分离与纯化的过程中将采用Sevag法去除粗多糖中的总蛋白，因此酶对于蛋白总量的影响可以忽略不计。

本研究采用单因素与正交试验相结合，优化复合酶法提取红蘑中的粗多糖工艺，其最优提取条件为A2B3C1D2，即酶解3h、酶解温度60℃、纤维素酶和木瓜蛋白酶的比例3:1(m/m)、pH5.0，粗多糖得率可达12.0%。与此前进行的经典水提法相比(热水浸提红蘑多糖得率为8%)，得率有了较大的提高，且具备提取条件温和，提取时间有所缩短，对多糖损伤小等特点，为红蘑人工培育成功后的多糖利用及工业化生产提供依据。

[1]上海农业科学院食用菌研究所. 中国食用菌志[M]. 北京: 中国林业出版社, 1991: 97-98.

Double-enzyme Method for Polysaccharides Extraction from Gomphidius rutilus Fruitbodies

LI Shu-qian1,2，ZHANG Bo1，XIN Guang1，YU Yang1，LIU Chang-jiang2,*
(1. Department of Chemistry, Anshan Normal University, Anshan 114007, China；2. College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)

For polysaccharide extraction, wild Gomphidius rutilus fruit bodies were hydrolyzed with cellulase and papain together. Based on single factor investigations, orthogonal array design was employed to optimize the hydrolysis process, and the optimum hydrolysis conditions were found as follows: hydrolysis temperature 60 ℃; cellulase/papain mass ratio 3:1; pH 5.0; and hydrolysis duration 3 h and the polysaccharide yield obtained under such conditions was 12.0%. This method has many advantages over conventional methods, such as gentle reaction conditions, time saving and less destructive effect on polysaccharide structure.

Gomphidius rutilus；polysaccharide；extraction；compound enzymes

TS201.22

A

1002-6630(2010)18-0143-04

2010-06-07

鞍山科技计划项目(08SF24)

李书倩(1975—)，女，博士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：susanli52@163.com

*通信作者：刘长江(1955—)，男，教授，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：liucj597@sohu.com