环介导等温扩增法快速检测阪崎肠杆菌

马寅众，陈江源，房国梁，李 琦，李 睿，周帼萍，刘志国,*

(1.武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2.江汉大学卫生职业技术学院，湖北 武汉 430016)

环介导等温扩增法快速检测阪崎肠杆菌

马寅众1，陈江源2，房国梁1，李 琦1，李 睿1，周帼萍1，刘志国1,*

(1.武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2.江汉大学卫生职业技术学院，湖北 武汉 430016)

目的：研究阪崎肠杆菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)方法，实现对食品中阪崎肠杆菌的快速检测。方法：针对阪崎肠杆菌16S rRNA基因(16S rDNA)及外膜蛋白A(OmpA)基因设计LAMP引物，扩增后通过电泳或加入显色剂SYBR-GREENⅠ检测。结果：LAMP法能有效特异地检测出阪崎肠杆菌；以16S rRNA引物检测阪崎肠杆菌的最低检出限为32CFU/mL，用OmpA引物检测阪崎肠杆菌的最低检出限达3CFU/mL，扩增产物加入SYBR-GREENⅠ在紫外条件下可见荧光，与电泳检测具有同样的灵敏度。结论：LAMP法可实现对阪崎肠杆菌的快速检测，在食品检测中具有广阔的应用前景。

阪崎肠杆菌；环介导等温扩增；快速检测

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)属肠杆菌科、肠杆菌属的革兰阴性无芽孢短小杆菌，为人和动物的肠道寄生菌和条件致病菌。阪崎肠杆菌毒力强，能导致新生儿脑膜炎、致死性小肠结肠炎和菌血症等疾病，尽管使用抗生素治疗可以康复，但伴随着严重的神经系统后遗症、发育障碍等症状，由该菌引起的感染死亡率高达50%以上[1-2]。

目前国内外对阪崎肠杆菌的检测多采用常规的分离培养生化鉴定方法[2-3]，最近，常规PCR方法和实时荧光PCR技术也被运用于该菌的检测[4-5]。但这些方法周期长、需要专业设备且费用高。

环介导恒温扩增法(loop-mediated isothermal

amplification，LAMP)是Notomi等[6]于2000年开发的一种新的恒温核酸扩增方法。利用特异引物及链置换DNA聚合酶在恒温条件下自循环几十分钟就可完成核酸扩增反应。该法具有特异性强、灵敏度高、快速、简便、易检测等特点，现已用于多种细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的检测[7-10]。本实验通过设计16S rRNA及OmpA两套LAMP引物，建立阪崎肠杆菌LAMP快速检测法，并通过比较两套引物的特异性及灵敏度选择其中较好的一套引物用于实际检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阪崎肠杆菌CICC 21544(Enterobacter sakazakii CICC 21544) 中国工业微生物菌种保藏中心；大肠杆菌DH5 α(E.coli DH5α)、大肠杆菌BL21(DE3，E.coli BL21) 本实验室保存；蜡样芽孢杆菌ATCC 33018(Bacillus cereus ATCC 33018)、枯草芽孢杆菌JXBS-1(B. subtilis JXBS-1)、炭疽芽孢杆菌CMCC 63605(Bacillus anthracis CMCC 63605)、金黄色葡萄球菌 JXSA-1(Staphylococcus aureus JXSA-1)、分枝杆菌WHTY7-1-4(Mycobacteria WHTY7-1-4)、醋酸菌FPYS1(Acetobacter FPYS1)、土壤杆菌BJTY-4 (Sphingomonas BJTY-4) 中国科学院武汉分院。

Bst DNA聚合酶 纽英伦生物技术有限公司；LAMP引物由上海生工生物工程有限公司合成；SYBR-GREEN I、dNTPs、DNA Marker DL100 上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温水浴箱 武汉市琴台医疗器械厂；YJ-1450超净工作台 江苏苏州净化设备公司；UNO Ⅱ聚合酶链式反应仪 德国Whatman Biometra公司；核酸电泳仪北京六一厂；UV-2000 GIS紫外分析仪 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA制备

煮沸法[11-12]制备DNA：取阪崎肠杆菌细菌纯培养物100μL于12000r/min离心5min，弃上清液，加入100μL无菌水混匀后，于100℃水浴15min裂解，冰浴2min，然后4℃、12000r/min离心5min，取4.0μL上清液用于LAMP扩增。

1.3.2 LAMP检测

通过Genebank Blast比对，选择阪崎肠杆菌16S rRNA(AY803190)及OmpA(DQ000206)基因序列作为设计LAMP引物的靶序列。分别设计16S rRNA和OmpA的外引物(F3、B3)和内引物(FIP、BIP)见表1。

表1 16S rRNA及OmpA的LAMP引物Table1 LAMP primers of 16S rRNA and OmpA

LAMP反应体系25μL含1.6μmol FIP、1.6μmol BIP、0.2μmol F3、0.2μmol B3、20mmol Tris-HCl(pH8.8)、10mmol KCl、2mmol MgSO4、10mmol (NH4)2SO4、 0.1% Triton X-100、1.4 mmol dNTPs、8U Bst DNA聚合酶、4.0μL模板DNA。先将除Bst DNA聚合酶以外的所有反应物在95℃水浴5min，然后迅速放在冰上冷却，冷却后加入Bst DNA聚合酶，63℃孵育40min，80℃孵育10min终止酶活性即完成了LAMP反应。LAMP产物产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析或直接加入SYBRGREENⅠ0.1μL在紫外条件下检测荧光性，快速判断LAMP反应是否发生[13]。

1.3.3 LAMP的特异性检测

用煮沸法制备大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21 (DE3)、 蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、分枝杆菌、醋酸菌、土壤杆菌DNA模板，分别用16S rRNA及OmpA引物进行LAMP扩增，以检测引物的特异性。

1.3.4 阪崎肠杆菌LAMP法灵敏度的检测

通过序列稀释接种，平板菌落计数检测菌浓度。用无菌三蒸水分别稀释模板至109倍，将每个稀释浓度进行LAMP反应，扩增产物进行电泳分析或加入显色剂SYBR-GREENⅠ，检测LAMP灵敏度，计算检出限。

2 结果与分析

2.1 阪崎肠杆菌LAMP法检测

对阪崎肠杆菌DNA模板分别用16S rRNA及OmpA LAMP引物进行扩增，均有阳性结果。如图1A所示产物是由若干茎环结构和类似花椰菜结构的DNA组成的混合物，电泳后在凝胶上显现出典型的梯状条带。反应结束后分别加入0.1μL SYBR-GREENⅠ在紫外下观察，见图1B、1C，其中无模板组无荧光反应，而扩增阳性组呈现明显的荧光反应。因此SYBR-GREENⅠ可用于LAMP反应产物的快速显示。

图1 阪崎肠杆菌16S rRNA及OmpA LAMP反应检测Fig.1 LAMP detection of Enterobacter sakazakii 16S rRNA and OmpA

2.2 阪崎肠杆菌LAMP反应的特异性

针对阪崎肠杆菌16S rRNA及OmpA设计的LAMP引物分别对阪崎肠杆菌和非阪崎肠杆菌DNA模板进行扩增，产物经凝胶电泳检测。如图2A所示，用16S rRNA引物LAMP扩增时除了阪崎肠杆菌有梯状条带产生外，大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)也有梯状条带产生；用OmpA引物LAMP扩增时只有阪崎肠杆菌有梯状条带产生，其他均为阴性(图2B)。结果显示，OmpA LAMP引物要比16S rRNA引物的特异性高。通过Blast发现阪崎肠杆菌的16S rRNA与大肠杆菌DH5α及大肠杆菌BL21(DE3)16S rRNA序列之间的相似度高达99%，所以检测呈现阳性，而其他菌株与阪崎肠杆菌种属关系较远所以检测为阴性。

图2 阪崎肠杆菌16S rRNA和OmpA LAMP反应特异性检测Fig.2 Detection specificity of LAMP reaction for Enterobacter sakazakii 16S rRNA and OmpA

2.3 阪崎肠杆菌LAMP检测的灵敏度

通过平板计数法算出阪崎肠杆菌菌浓度为3.2×109个菌/mL，用无菌三蒸水将模板以10倍梯度稀释至109倍，每个稀释度分别用16S rRNA引物和OmpA引物进行LAMP扩增。电泳显示当模板稀释107倍时16S rRNA引物LAMP扩增仍可检测出(图3A)；当模板稀释108倍时OmpA引物LAMP扩增仍可检测出(图3B)。换算出阪崎肠杆菌的检出限，16S rRNA引物LAMP扩增检测阪崎肠杆菌的最低检出限为32CFU/mL；而OmpA引物的最低检出限为3CFU/mL。反应结束后各管加入0.1μL SYBR-GREENⅠ在紫外下检测，当模板稀释107倍时16S rRNA引物进行LAMP反应产物仍能呈现出荧光(图3C)；而模板稀释108倍时OmpA引物的LAMP产物仍能呈现出荧光。说明利用SYBR-GREENⅠ具有与电泳同样的灵敏度，可代替电泳法实现阪崎肠杆菌的快速检测。

图3 阪崎肠杆菌16S rRNA和OmpA LAMP反应灵敏度检测Fig.3 Detection sensitivity of LAMP reaction for Enterobacter sakazakii 16S rRNA and OmpA

3 讨 论

由于阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症等症状，死亡率高达50%，因此对该菌的及时检测十分重要。尽管免疫学检测方法在微生物检测中得到广泛应用[14-15]，但尚未有针对阪崎肠杆菌的免疫学快检方法。目前国内外对阪崎肠杆菌的检测多采用微生物学方法，通过常规的分离培养及生化鉴定。近年来，一些针对核酸的检测方法迅速发展，如采用普通PCR和实时荧光PCR方法等，这些方法也具有快速检测的特点，但在特异性和灵敏度上尚有不足，且设备要求高，不太适用于基层的检测要求。而采用LAMP检测方法可弥补这些不足。

有文献报道，针对阪崎肠杆菌的16S～23S rRNA间区序列(ITS)设计LAMP引物成功检测出阪崎肠杆菌[16]。但是由于16S～23S rRNA间区序列进化上的保守度高，同一种属之间的差异非常小，因此检测的特异性较低，

易导致较多的假阳性结果。为此，本实验选择设计了针对阪崎肠杆菌16S rRNA和OmpA的LAMP引物，增加了检测的特异性。

特异性分析中选用了大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、分枝杆菌、醋酸菌、土壤杆菌等菌株，对比检测16S rRNA引物及OmpA引物的特异性。结果显示：大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21 (DE3)用16S rRNA引物扩增时出现了假阳性，而OmpA引物扩增均为阴性，说明OmpA引物的特异性高于16S rRNA引物特异性。进一步对OmpA引物的扩增靶序列进行Blast分析，一致性较高的有沙门氏菌、志贺氏菌，对这些菌的16S rRNA进行Blast分析，显示它们具有较低的一致性。这表明，同时检测这两个靶序列可大大提高检测的特异性。

此外，本实验采用荧光染料SYBR-GREENⅠ替代凝胶电泳，使检测结果的观察更加直观、简洁，再结合该法高灵敏度和特异性强，使其更适合推广应用，在食品中阪崎肠杆菌的检测方面具有广阔的应用前景。

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Rapid Detection of Enterobacter sakazakii by LAMP

MA Yin-zhong1，CHEN Jiang-yuan2，FANG Guo-liang1，LI Qi1，LI Rui1，ZHOU Guo-ping1，LIU Zhi-guo1,*
(1. School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. School of Health Science, Jianghan University, Wuhan 430016, China)

Objective: To develop a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for rapid detection of Enterobacter sakazakii in food. Methods: LAMP primers were designed on the basis of 16S rRNA gene (16S rDNA) and outer membrane protein A gene (OmpA) in Enterobacter sakazakii. The LAMP products were evaluated by electrophoresis or SYBR-GREEN I. Results: The detection limit of Enterobacter sakazakii by LAMP assay was 32 CFU/mL using 16S rRNA primers or 3 CFU/mL using OmpA primers. The similar detection sensitivity of LAMP products using SYBR-GREEN I and electrophoresis was observed. Conclusion: LAMP method was effective and sensitive for rapidly detecting Enterobacter sakazakii, which will have a broad application prospect in food.

Enterobacter sakazakii；loop-mediated isothermal amplification；detection

Q93.3

A

1002-6630(2010)22-0322-04

2010-06-30

武汉市科技局对外科技合作与交流计划项目(201070934341)；武汉工业学院研究生创新基金重点项目(09cx002)

马寅众(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为食品安全与食品检测技术。E-mail：sdjnhr@163.com

*通信作者：刘志国(1963—)，男，教授，博士，研究方向为生物技术与食品安全。E-mail：zhiguo-1@126.com