响应曲面法优化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工艺

宋婉睿，聂少平，胡晓鹃，高丽英，邱奇琦，李 昌，谢明勇*

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

响应曲面法优化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工艺

宋婉睿，聂少平，胡晓鹃，高丽英，邱奇琦，李 昌，谢明勇*

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

采用响应曲面法对紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工艺进行优化。在单因素试验基础上，建立影响香豆雌酚粗提取物得率的3个主要因素即液料比、提取温度和提取时间与提取率之间的数学模型。利用SAS V8.0软件分析表明：在液料比27.28:1(mL/g)、提取温度67.7℃和提取时间13.77h时，香豆雌酚粗提取物得率较高，最佳提取率为2.64‰，与预测值基本相符。

紫花苜蓿；香豆雌酚；提取；响应曲面法

香豆雌酚(coumestrol)，又名考迈斯托醇、拟雌内酯，是一种含雌激素活性的晶状化合物，最初被提取于白三叶草中，因其结构与当时已发现的异黄酮类植物雌激素不同，而是一种香豆素衍生物，故被命名为香豆雌酚[1]。研究表明：香豆雌酚为苯并呋喃并香豆素，单一成分，是一种主要存在于紫花苜蓿等豆科植物的具有拟雌激素作用和抗雌激素作用的天然活性物质[2]。现代研究已证实植物雌激素对女性绝经综合症[3]、心血管疾病[4]、癌症[5]、骨质疏松[6]及生殖系统[7]等都具有较好的调节作用，且其中的一些功能也已在香豆雌酚的研究中得到证实[8-10]，但由于其许多方面尚处于研究阶段，还未广泛地应用到制药和保健品等领域。

近年来，对于香豆雌酚的研究已逐渐受到重视，但大多集中在香豆雌酚的检测及生物活性方面[11-14]，有关香豆雌酚的提取却很少提及。本实验采用甲醇回流浸提的方法对紫花苜蓿中的香豆雌酚进行粗提取，在单因素试验的基础上，采用响应曲面法(response surface methodology，RSM)[15-16]对温度、时间、液料比3个主要影响香豆雌酚粗品提取率的因素进行优化，探索紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取的最佳工艺，为香豆雌酚的提取提供新的有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

去脂的紫花苜蓿干粉：紫花苜蓿干草(浙江)粉碎过40目筛，索氏除脂后干燥备用。

香豆雌酚标准品(纯度99%以上) Sigma公司；甲醇、石油醚(均为分析纯)。

1.2 仪器与设备

FA1104电子天平 上海精天电子仪器厂；TU-1990双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；SHZIIIB循环水真空泵 上海亚荣生化有限公司；DFY-500粉碎机 温岭市大海药材器械厂；索氏抽提器 上海精密仪器有限公司；DGG-9140B电热鼓风干燥箱、D2G-6050真空干燥箱 上海森信实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香豆雌酚标准曲线的绘制

精密称取香豆雌酚标准品5.5mg，用少量甲醇溶解后置于100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配成55mg/L的标准品储备液。精密量取标准品储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配成2.75、5.5、8.25、11、13.75、16.5mg/L的香豆雌酚甲醇溶液，于波长343nm处测定吸光度[1]，另取甲醇溶液作为空白对照。以香豆雌酚质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制香豆雌酚标准曲线。

1.3.2 样品中香豆雌酚粗品的单因素提取及含量的测定

称取去脂的紫花苜蓿干粉2.00g，放入250mL烧瓶中，按一定的液料比加100%甲醇溶液，在一定温度下提取一定时间，冷却，过滤。滤液于100mL容量瓶定容，精密吸取样品液1mL，置10mL容量瓶中定容测定吸光度，按标准曲线计算紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物的含量。

1.3.3 紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的计算

1.3.4 响应曲面试验设计

表1 响应面因素水平编码表Table1 Factors and levels of response surface experiments

在单因素试验基础上，选取3个主要影响紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的因素即液料比(mL/g)、提取温度/℃以及提取时间/h，采用三因素三水平的Box-Behnken试验设计(表1)及分析方法对紫花苜蓿中香豆雌酚提取工艺进行优化[17]。

2 结果与分析

2.1 香豆雌酚标准曲线

香豆雌酚的标准曲线回归方程为C=0.09533A＋0.00571，R2=0.9997，线性良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 液料比对香豆雌酚提取的影响

在提取时间3h、提取温度50℃条件，研究7种不同液料比对紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的影响，分别为10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1 (mL/g)，结果见图1。

图1 液料比对香豆雌酚粗提取物得率的影响Fig.1 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

由图1可知，液料比的变化对紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物的得率有较大的影响。随着液料比的增加，香豆雌酚粗提取物的得率先增加后降低，在液料比为25:1时得率达到最高。此结果与多数酚类研究类似[17]。

2.2.2 提取温度对香豆雌酚提取的影响

图2 提取温度对香豆雌酚粗提取物得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

在液料比25:1(mL/g)、提取时间3h条件下，设定30、40、50、60、65、70℃ 6个温度，研究提取温度对紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的影响。结果如图2所示，随着温度的提高紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率增加显著，在65℃时达到最大，随后得率有所下降，可能由于过度高温破坏了香豆雌酚的结构。

2.2.3 提取时间对香豆雌酚提取的影响

图3 提取时间对香豆雌酚粗提取物得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

在液料比25:1(mL/g)、提取温度50℃条件，设定3、6、9、12、15、17、19h 7个提取时间，研究提取时间对紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的影响。结果如图3所示，随着时间的增加紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率增加显著，在12～17h之间呈现平稳，随后得率有所下降，可能由于提取时间过长，香豆雌酚受到了破坏。

2.3 响应曲面试验分析与优化

2.3.1 试验结果与模型建立

表2 响应面分析试验设计及结果Table2 Design and results of orthogonal experiments for the extraction of crude coumestrol from Alfalfa

试验结果见表2，利用SAS V8.0统计软件对数据进行回归拟合，得到香豆雌酚粗提取物得率对以上3个因素的二次多项回归模型为：

2.3.2 方差分析

表3 回归方程方差分析Table3 Variance analysis for regression equation

利用SAS Rsreg程序对表2数据进行回归分析(表3、4)。结果表明，以紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率为响应值所建立的回归模型具有高度的显著性。方程一次项、二次项、交叉项和总回归的影响都显著，并且一次项中X1、X2极显著，X3显著，而二次项中X22极显著，X1X2和X2X3次之，表明各因素对紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率的影响都不是简单的线性关系。

表4 回归方程偏回归系数的估计值Table4 Estimated value of partial regression coefficients for regression equation

从表4可见，方程的决定系数为97.26%，R2Adj= 92.32%，由此可知，用上述回归方程描述各因素与响应值即紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率之间的关系时，其因变量和自变量之间的线性关系显著，其回归方程的拟合程度和可信度均较高，能够很好地对紫花苜蓿香豆雌酚粗提取物得率进行很好的预测。且由表4中P值可知，各因素影响程度从大到小为液固比、提取温度和提取时间。

2.3.3 响应曲面分析

利用SAS软件的Rsreg程序进行典型分析，得到各因素的最优值的代码值X1=0.455219、X2=0.532936、X3=－0.617042，换算后得出相应的实际值为液料比27.28:1 (mL/g)、浸提温度67.7℃、提取时间13.77h，此时紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率理论值Y=2.62‰。

图4 液料比(X1)与提取温度(X2)对紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率影响的响应曲面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between material-liquid ratio and extraction temperature on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

图5 液料比(X1)与提取时间(X3)对紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率影响的响应曲面和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between material-liquid ratio and extraction time on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

图6 提取时间(X3)与提取温度(X2)对紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率影响的响应曲面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction time and extraction temperature on extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa

2.3.4 回归模型的验证实验

采用上述优化条件进行3次平行实验，检测响应曲面法所得结果的可靠性，实际测得的紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物的平均得率为2.64‰，实验值与理论值的相对误差为0.76%，证明应用响应曲面法优化紫花苜蓿中香豆雌酚提取工艺的可行性较高。

3 结 论

研究表明：采用响应曲面法优化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工艺，其香豆雌酚粗提取物的得率在液料比27.28:1(mL/g)、提取温度67.7℃、提取时间13.77h时达到最大，此时紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率为2.64‰，与预测值2.62‰的相对误差为0.76%。

[1]BICKOFF E M, BOOTH A N, LYMAN R L, et al. Coumestrol, a new estrogen isolated from forage crops[J]. Science, 1957, 126: 969-970.

[2]BICKOFF E M, LIVINGSTON A L, WITT S C, et al. Isolation of coumestrol and other phenolics from alfalfa by countercurrent distribution [J]. Phurm Sci, 1964, 53(12): 1496-1499.

[3]MURKIES A L, LOMBARD C, STRAUSS B J, et al. Dietary flour suppleentation deereases post-menopausal hot flushes: effect of soy and wheat[J]. Maturitas, 1995, 2(3): 189-195.

[4]GLAZIER M G, BOWMAN M A. A review of the evidence for the use of phytoestrogens as a replacement for traditional estrogen replacement therapy [J]. Archives Internal Medicine, 2001, 161(9): 1161-1172.

[5]LAMARTINIERE C A, MOORE J, HOLLAND M, et al. Neonatal genistein chemoprevents mammary cancer[J]. Pro Soc Exp Bio Med, 1995, 208(l): 120-123.

[6]GAO Y H, YAMAGUCHI M. Anabolic effect of daidzein on cortical bone in tissue culture: Compatison with genistein effect[J]. Mol Cell Biochem, 1999, 194(1): 93-98.

[7]HUGHES C L Jr. Effects of Phytoestrogens on GnRH-induced luteinizing hormone secretion in ovarieetomized rats[J]. Reprod Toxicol, 1987 (3): 179-181.

[8]WANG H W, LI H, MOORE L B, et al. The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor[J]. Mol Endocrinol, 2008, 22(4): 838-857.

[9]WU X T, WANG B, WEI J N. Coumestrol promotes proliferation and osteoblastic differentiation in rat bone marrow stromal cells[J]. Biomedical Materials Reseearch Part B-Applied Biomaterials, 2009, 90B(2): 621-628.

[10]HEDELIN M, LOF M, OLSSON M, et al. Dietary phytoestrogens are not associated with risk of overall breast cancer but diets rich in coumestrol are inversely associated with risk of estrogen receptor and progesterone receptor negative breast tumors in Swedish women[J]. Nurition, 2008, 138(4): 838-857.

[11]谢皓, VEGVARI G, SANDOR G, 等. 大豆品种香豆雌酚含量的分析[J]. 北京农学院学报, 2008, 23(3): 7-9.

[12]韦继南, 吴小涛, 陈晓刚, 等. 香豆雌酚对新生大鼠成骨细胞增殖分化的影响[J]. 东南大学学报: 医学版, 2007(2): 112-116.

[13]陈晓钢, 吴小涛, 许勇. 香豆雌酚对体外破骨细胞分化和骨吸收活性的影响[J]. 中国临床康复, 2006, 39(10): 86-88.

[14]吴小涛, 陈晓钢, 许勇, 等. 香豆雌酚对去卵巢大鼠成骨细胞MT1-MMP和TIMP-1基因表达的影响[J]. 中国骨质疏松杂志, 2007(11): 764-768.

[15]BOX G P, BEHNKEN D W. Some new three level designs for the study of quantitative variables[J]. Technometrics, 1960, 2(4): 456-475.

[16]李涛, 岳田利, 袁亚宏. 苹果多酚提取的响应曲面法优化研究[J]. 食品科技, 2007(8): 118-121.

[17]黄璞, 谢明勇, 聂少平, 等. 响应曲面法优化微波辅助提取黑灵芝孢子多糖工艺研究[J]. 食品科学, 2007, 28(10): 200-203.

Optimal Extraction of Coumestrol from Alfalfa by Response Surface Methodology

SONG Wan-rui，NIE Shao-ping，HU Xiao-juan，GAO Li-ying，QIU Qi-qi，LI Chang，XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The extraction processing of coumestrol from Alfalfa was optimized by response surface methodology (RSM). On the basis of single-factor experiments, a mathematical regression model was established for predicting between extraction rate of crude coumestrol and three critical extraction factors including material-liquid ratio, extraction temperature and extraction time. The optimal extraction processing parameters were material-liquid ratio of 27.28:1 (mL/g), extraction temperature of 67.7 ℃ and extraction time of 13.77 h. Under these optimal conditions, the actual extraction rate of crude coumestrol from Alfalfa was 2.64‰, which was well consistent with the predicted value. These results can provide a theoretical reference for the extraction of coumestrol from Alfalfa.

Alfalfa；coumestrol；extraction；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2010)22-0242-05

2010-06-28

南昌大学国际科技合作项目(2010DFA31780)

宋婉睿(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品科学。E-mail：ojecar2000@126.com

*通信作者：谢明勇(1957—)，男，教授，博士，研究方向为食品化学与分析、食品营养与安全。E-mail：myxie@ncu.edu.cn