半抗原免疫分析在食品安全检测中的应用

张小莺，赵津子，陈 琛，韩水仲，田泽华

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西理工学院 陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723000)

半抗原免疫分析在食品安全检测中的应用

张小莺1，赵津子1，陈 琛2，韩水仲1，田泽华1

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西理工学院 陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723000)

综述近几年来关于小分子半抗原的设计、人工抗原合成的研究，以及人工抗原合成中尚存在的问题和计算机模拟技术在半抗原合成中的应用；介绍多克隆抗体、单克隆抗体、卵黄抗体及基因工程抗体在食品安全检测中的应用，分析近年来ELISA、胶体金免疫层析和新兴的免疫传感器技术研究与应用现状和发展趋势。半抗原免疫学检测方法具有较低的检测极限、快速、方便、低廉等优势，是食品安全检测的发展方向。半抗原合成的可控设计、有效抗体的规模化生产，通过与新型免疫分析技术结合以期达到高通量、低成本、实时多重检测是今后食品安全免疫学检测中重要的技术突破点。

免疫分析法；半抗原；食品安全

食品安全与人类健康有直接关系，近年来因食用受到严重污染的食品而造成中毒的事件屡有发生，使人们对食品安全问题越来越重视。目前对食品中主要污染物，尤其是药物残留的检测主要包括两个方向：1)色谱、质谱、紫外、红外等以仪器为主的确证检测方法；2)ELISA试剂盒、胶体金检测试纸条、免疫传感器等免疫学快速筛选检测技术。仪器检测所需成本高、样品前处理较繁琐、对操作人员素质要求高、不适合大量样品的筛选和检测，不适于现场监测。而免疫分析法(immunoassay，IA)快速、简便、灵敏，一般不需要贵重仪器，可大大简化样品前处理过程，对使用人员的专门技术要求不高，易普及和推广，尤其适宜现场筛选和大量样品的快速分析，IA以其独特的优势在食品安全检测中占有重要地位。本文综述免疫学方法在食品安全检测领域的研究与应用，并对今后的发展趋势进行分析。

1 食品小分子污染物免疫分析法(IA)的原理

IA是将免疫反应与现代测试手段相结合而建立的超微量测定技术。待检的食品污染物如兽药残留、农药残留、食品添加剂、部分生物毒素、食品增色剂等，它们分子质量都较小，仅具有与相应抗体或致敏淋巴细胞的反应原性，而无免疫原性，通常不能激发免疫反应，称之为半抗原。但半抗原通过一定长度的碳链与载体蛋白结合后得到的人工抗原可刺激动物机体产生特异性的抗体，这为食品小分子污染物检测提供了新的发展方向。小分子食品污染物免疫检测的开发包括以下几个步骤：目标分析物确定，设计并合成半抗原，半抗原与载体蛋白连接合成人工抗原，人工抗原免疫动物制备抗体，建立目标分析物的免疫学检测方法。IA以抗原-抗体反应为基础，因此人工抗原刺激机体产生抗体亲和力的高低是建立IA的决定因素。

2 小分子食品污染物人工抗原的合成

2.1 半抗原的设计

半抗原潜在免疫特性的高低主要取决于基团结构的复杂性、结构中环的数目、杂原子的数目和不均一性。通常结构较复杂、分子质量较大的半抗原在进一步免疫实验中较易成功，而分子质量较小和化学结构过于简单的半抗原较难诱导动物产生抗体，但也有成功的。Tuomola等[1]用分子质量仅为131D的3-甲基吲哚上的羰基与较长的连接臂连接，合成9个人工抗原，进一步筛选得到特异性单抗。

半抗原设计的目的是使半抗原刺激机体产生特异性免疫应答，并获得对待测物有高亲和力的抗体。半抗原设计时免疫原中半抗原的分子结构、立体化学、电子分布应与待测物尽可能相似。此外，为突出待测物分子的特征结构，设计时常在特征结构和载体蛋白之间引入一定长度的连接分子，即连接臂。通常认为连接臂的最适长度在3～6个碳原子[2]，如连接臂太短或缺失，半抗原有可能被载体蛋白的三维结构掩盖而不利于其充分暴露，过长又会因疏水作用而造成半抗原分子构型折叠，导致半抗原分子靠近载体蛋白表面而被屏蔽，不利于抗原递呈细胞的识别。间隔臂的长度对分析的灵敏度及所产生的抗体对半抗原本身的识别情况都有影响。

引入连接臂位点的选择产生抗体的特异性有很大的影响。如果待测半抗原有多个可供选择的偶联位点，则可尝试利用多个位点分别合成多种人工抗原，然后筛选出较理想的人工抗原。不同的偶联位点会导致分子极性、构型、电子云分布及空间构型的不同，从而可能引起免疫系统识别不同的抗原决定簇。

此外，根据测定对象是单一半抗原或是一组结构相似的半抗原，设计中应考虑突出特定半抗原的结构或一组半抗原中共有的特征结构部分。Xu等[3]设计的具有硫代磷酸根和苯环的非特异性半抗原产生的广谱抗体对7种常用的有机磷农药都有较高的敏感性。

2.2 人工抗原的合成

2.2.1 载体蛋白的选择

目前常用载体蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)、鸡卵溶菌酶(HEL)[4]等。BSA因其物化性质稳定、不易变性、价廉易得，而且其赖氨酸含量高(即半抗原与载体的偶联密度较大)，而使用最多。

一般认为自身蛋白不适宜作为免疫载体。但有研究表明机体仍存在针对某些自身蛋白的T细胞克隆，吴瑜等[5]认为自身蛋白作为载体不仅可以消除载体本身B细胞表位的干扰，还可以避免异源蛋白作为载体引起的一些过敏反应，所以自身蛋白也有作为免疫蛋白的潜力。

选择的载体不应与检测体系中的成分发生交叉反应，如需要将人工抗原的抗体用于血液学检测中，就不应选用BSA、OVA、HSA、兔血清白蛋白(RSA)，但可用多聚赖氨酸(PLL)作为载体。在ELISA实验中免疫用人工抗原与包被用人工抗原所采用的载体蛋白应不同，以避免其干扰检测[6]。陈继明等[7]认为免疫原和包被原所用载体蛋白结构和分子质量差异越大，非特异性结合反应越弱，分析灵敏度越高。

2.2.2 人工抗原的合成方法

半抗原与载体偶联时应根据半抗原的化学结构，以及反应方式选择适当的偶联方法，偶联时应保证半抗原的活性及理化性质不发生改变。常见的偶联方法有混合酸酐法、碳二亚胺法、戊二醛法、重氮法等。江媛媛等[8]首次用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(双环氧试剂)为偶联剂运用双交联法制备桔霉素-蛋白偶联抗原，免疫BALB/C小鼠，获得抗桔霉素多克隆抗体效价达到1.1×105。

针对不含氨基和羧基的半抗原，还可以通过引入羧基和改造反应基团实现偶联。具体方法选用要视半抗原所具有的官能团的结构而定，在半抗原和蛋白的偶联过程中还应充分考虑到半抗原与载体的比例，偶联时pH值、温度、光照、渗透压、加样速度等条件对偶联效果的影响。

2.2.3 人工抗原的鉴定

对于人工抗原的鉴定，目前采用的方法有：紫外吸收法、标记抗原示踪法和SDS-PAGE等。这些方法操作均比较繁琐，结果准确性较差。常用的紫外吸收法要求小分子化合物要有紫外吸收，否则无法确定，且针对不同的小分子化合物计算方法存在许多差异。张淑

玲等[9]根据公式{[A325nm(结合物)－A325nm(牛血清白蛋白)]/ ε325nm(诺氟沙星)}/牛血清白蛋白的浓度(mol/L)=诺氟沙星与牛血清白蛋白的偶联率。刘悦竹等[10]根据公式：结合比=[ε232(结合物)－ε232(载体蛋白)]/ε232(半抗原)(式中：ε为摩尔消光系数)计算有机磷农药与载体蛋白的结合比。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定人工抗原与载体的偶联比操作简单，微量样品点到靶上即可开始测定，几秒后可得到谱图和数据，根据分子质量的变化简单计算即得偶联比。该方法简便、快速、且结果准确，值得推广。

半抗原与载体的偶联存在最佳比例，较高偶联比的人工抗原能够较快的诱导产生较高效价的抗体，但是偶联比过大会影响抗体的亲和性和特异性[11]，一般来说当偶联比为3:1～45:1时免疫原性较强。

2.2.4 人工抗原合成的现状

目前，人工抗原的合成仍是以大量筛选的“试错法”为主，即预先设计几个人工抗原免疫动物，通过获得的抗体来评价人工抗原的优劣，这些设计方法工作量大且带有很大的经验性和随意性，影响了抗体的效价与开发的可控性。计算机辅助分子建模(computer-assisted molecular modeling，CAMM)等手段的出现，为人工抗原的合成提供了新的发展方向。CAMM是通过X-单晶衍射等技术或已有实验数据获得化合物的三维结构、电子分布与电子特性、空间位阻、疏水性、热力学稳定性等信息，利用分子力学、分子动力学和量子力学等理论确定分子构象或者相关的分子间相互作用以及动态行为，进而可视化的显示这种空间模型或相互作用[12]。Galve等[13]用CAMM对氯苯酚类化合的半抗原设计进行了系列研究，比较预先设计的3种半抗原偶联物空间结构及电子构型与待分析物(2,4,6-三氯苯酚)的区别，并通过主成分分析(principal component analysis，PCA)筛选出与目标分析物具有最大相似度的半抗原，通过Hyperchem软件优化分子构型，得到最稳定的分子构象，并从热力学角度比较半抗原之间的差异，筛选出与2,4,6-三氯苯酚具有最大相似度的半抗原，免疫动物获得的抗体对目标分析物具有较高的敏感性和特异性，IC50为(2.76±0.26)μg/L。抗原-抗体的相互作用是基于由分子电子特性所决定的原子空间排列及相互作用，运用CAMM可以更为合理的解释实验前不能预料的交叉反应率的结果，从而帮助改进半抗原的设计，提高抗体的亲和力以及广谱性[14]。在一些研究中[15-17]，CAMM帮助研究者提高了抗体的广谱性，如Wang等[15]开发的一种广谱特异性单克隆抗体与氟喹诺酮类的12种抗生素都呈现较高的交叉反应率(30%～100%)。通过CAMM考察目标化合物的共同构型和电子特性，预测具有待分析物共同结构而非单个化合物特异结构的半抗原，从而获得广谱性的抗体，为多残留免疫检测方法的发展提供了一条新的思路。

3 半抗原抗体类型

3.1 多克隆抗体

多抗制备简单、价格低廉，但由于半抗原-载体复合物有多个结合位点，免疫系统会产生具有不同特异性的多抗，故可在免疫检测使用之前通过亲和层析等纯化手段提高抗体的特异性与均质性，这也限制了多抗的应用。

3.2 单克隆抗体(mAb)

单抗特异性强、高度均质和易于标准化，应用于药残分析筛选具有特异、灵敏、快速、简便、痕量检测，以及可大批量样本检测的优点，在IA检测法中已得到较广泛的应用。

3.3 卵黄抗体(IgY)

IgY是指从免疫禽蛋中提取的针对特定抗原的多抗。IgY产量高(1只蛋鸡每周的抗体产量相当于9～10只兔同期抗体产量)、易于获得、使用方便、理化性质稳定、成本低廉、抗体表达时间长且平稳、又符合动物福利原则。更为重要的是，IgY因其物种距离而带来一系列抗体特性优势，与哺乳动物成分交叉反应少，可减少假阳性的产生，尤其适合于检测、诊断试剂的开发[18]。桔霉素(CIT)是由青霉菌属和曲霉菌属的某些菌株产生的真菌毒素[19]。桔霉素具有严重的致畸、致癌和诱发基因突变等作用，人和动物食用含用CIT的食物后会造成肝肾损伤[20]。Duan等[21]用CIT人工抗原免疫鸡产生的IgY建立间接ELISA法检测CIT最低检测限为10ng/mL，抗CIT IgY与CIT替代物赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B和脱氧萎镰菌醇的交叉反应率分别为0.08%、0.05%和0.02%。

在多克隆IgY的基础上还可以引入一种单克隆IgY (mIgY)的概念，这种抗体兼具IgY种属距离优势和单抗的高特异性与表达稳定性，抗体的专一性将进一步加强。陈红秀等[22]在文章中具体阐述了mIgY的研发思路，若将其应用在食品安全检测中有望进一步提高检测的特异性与灵敏性。

3.4 基因工程抗体

通过基因工程方法可以从细胞系中直接克隆、筛选到抗体基因，并进一步进行定向改造，如提高抗体的亲和力等，Moghaddam等[23]制备的黄曲霉毒素单链抗体亲和力为6×10-9mol/L。同时筛选得到的抗体基因可以在宿主细胞中表达，方便抗体的大规模生产。基因工程抗体的制备与研究开发可以在一定程度上解决半抗原抗体制备难的问题。与多抗和单抗相比，基因工程抗体的筛选范围广、生产周期短、操作简便、生产成本低[24]。

4 免疫学检测方法在食品安全检测中的应用

4.1 酶联免疫检测方法(ELISA)

ELISA是目前食品安全检测常用的免疫分析法，可定性和定量检测。早在1995年，欧盟就已禁止苏丹红作为食品添加剂使用，但由于其成本较低，增色效果突出，在食品中仍时有非法添加，对人体健康造成威胁。Wang等[25]建立的基于高特异性抗苏丹红Ⅰ单抗的ELISA法检测限达0.07～0.14ng/mL，与苏丹红Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的交叉反应率分别为9.5%、33.9%和0.95%。Strasser等[26]利用磺胺嘧啶的单抗建立的ELISA对牛奶中磺胺嘧啶残留最低检测极限达9ng/mL。目前已有许多商品化的ELISA试剂盒可初步检测食品中存在的小分子污染物，但ELISA操作步骤繁多，延长了检测时间，且成本较高。

4.2 胶体金免疫层析检测

将小分子半抗原抗体用金颗粒标记形成金标抗体，半抗原与其人工抗原竞争性结合金标抗体，从而使检测线和质控线由于样品中所含药物量的不同呈现不同颜色。传统胶体金检测只能定性，或通过反应颜色深浅半定量，检测的灵敏度也不高，检测范围有待于进一步扩宽。但也可通过以下方式实现胶体金定量检测：1)检测线的设计只能结合一定量的分析物，任何过量的分析物将会和下一条检测线结合，产生一个温度计式的条带梯度；2)应用光密度计测量显色带的颜色强度，将颜色强度转为数字化指标实现定量检测。Lisa等[27]运用建立了IgY抗体胶体金的试纸条检测有机磷杀虫剂DDT的残留，最低检测限为27ng/mL。

胶体金试纸条还可采用多膜复合或单模多元受体固定实现多元检测。Kranthi等[28]建立了在一条胶体金检测试纸条固定拟除虫菊酯-蛋白和硫丹-蛋白来同时检测样品中拟除虫菊酯和硫丹的残留。

目前许多商品化的胶体金试纸条检测食品中的小分子污染物方便、敏感、特异、无污染，检测时间仅需5～10min，非常适合现场检测，可用于大量样品的快速筛选。

4.3 免疫传感器

免疫传感器作为食品安全检测技术具有精确度高、敏感性高、样品前处理简单、检测迅速(每个样品只需十几秒至几分钟)、操作简单、携带方便、高度自动化、可重复利用等优点，减少了对使用者及环境、技术条件的依赖，适于现场或野外操作，正成为食品安全快速检测研究的新热点。近年来由于不合理和非法用药导致兽药残留超标引起的食物中毒事件屡有发生，对于兽药残留的检测也越来越受到重视。Situ等[29]比较了免疫传感器法和ELISA法测定猪胆汁中两种磺胺药物残留的效果，并用HPLC法验证。在测定的2081个样品中，ELISA法测定磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶假阳性率为1.54%和1.44%，假阴性率为0.14%和0.24%；传感器法的假阳性率分别为0.14%和0.34%，均无假阴性，可见免疫传感器检测结果更可靠。关于食品小分子污染物检测免疫传感器法的应用已有不少，表1列举了部分实例。

表1 免疫传感器对食品中小分子污染物的检测Table 1 Detection of small molecule contaminants in foodstuffs using immunosensors

微型化、集成化、智能化、多功能化是未来免疫传感器的发展趋势和重点方向，开发成本低、稳定性高、高寿命的免疫传感器是目前研究的热点[36]。目前研究中，Knecht等[37]把10种抗生素的半抗原点样法固定在硅烷化处理的载玻片上，形成半抗原阵列，进而把点好样的载玻片固定到流通池中，通过阵列检测器可同时检测牛奶中的10种抗生素，实现多组分的同时检测。Morais等[38]用CD/DVD检测技术来检测农药阿特拉嗪的残留，检测限为0.04μg/L。该研究为免疫传感器的发展提供了新的方向，利用CD/DVD不仅可以同时对成千份样品进行检测，而且生产成本低廉，检测高度自动化，可以视之为免疫检测中的重大飞跃。随着多学科的综合发展，免疫传感器将在食品安全检测中有广阔的应用前景。

5 结 语

食品安全免疫学检测具备上述一系列特点和优势，应用越来越广。当前免疫学检测不仅对检测的灵敏性、方便性和经济性提出更高要求，而且对检测的广谱性、高通量性和在同一样本中同时检测不同半抗原提出了要求。笔者大胆推测，从技术进步角度讲，对半抗原可控、可预测的抗原化设计以及所开发抗体结合新型免疫学检测技术可以进一步降低成本，提高检测效果与效率，满足对样品的高通量处理和实时对同一样本的多种成分进行有效分析与检测，将在今后食品安全检测获得进一步重视与突破。

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Research Progress of Applications of Hapten-based Immunoassay in the Detection of Food Safety

ZHANG Xiao-ying1，ZHAO Jin-zi1，CHEN Chen2，HAN Shui-zhong1，TIAN Ze-hua1
(1. College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；2. Bio-resources Key Laboratory of Shaanxi Province, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China)

Immunoassay is one of the most important methods for the detection of food safety. This article reviews the design and synthesis of artificial antigens, the design of haptens, current problems of artificial antigens and applications of computation technology in hapten synthesis. Meanwhile, the applications of polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, IgY antibodies, and genetically engineered antibodies in the detection of food safety are also discussed. Furthermore, comprehensive information on major immunological methods such as ELISA, gold-based colloidal immunochromatographic assay and immunosensor is also summarized. Hapten immunoassay methods for food safety detection have the advantages of low detection limit, fast detection, convenience and low cost. However, several key techniques including the predictable design of artificial antigens, the mass production of high-tittered antibodies and the combination with novel immunoassay methods for meeting the requirement of high-throughput screening and real-time multiple detection also need to be improved.

immunoassay；hapten；food safety

R392.11

A

1002-6630(2010)17-0397-05

2010-01-26

西北农林科技大学引进人才启动专项基金项目(01140407)；2009年度西北农林科技大学基本科研业务费青年项目(Z109021003)；西北农林科技大学国家级动物科学实验教学示范中心实验室开放创新基金项目

张小莺(1976—)，男，教授，博士，主要从事药理学和抗体技术研究。E-mail：zhang.xy@nwsuaf.edu.cn