富硒金针菇对羟自由基的清除作用

李华为，赵素云，铁 梅,*

(1.沈阳师范大学化学与生命科学学院，辽宁 沈阳 110034；2.辽宁大学环境学院，辽宁 沈阳 110036 )

富硒金针菇对羟自由基的清除作用

李华为1，赵素云2，铁 梅2,*

(1.沈阳师范大学化学与生命科学学院，辽宁 沈阳 110034；2.辽宁大学环境学院，辽宁 沈阳 110036 )

采用现代分离技术从富硒金针菇中提取硒多糖和硒蛋白，采用苯酚-硫酸法、ICP-MS法和考马斯亮蓝染色法对硒多糖中多糖含量、硒含量及硒蛋白中蛋白和硒的含量进行测定；在Fenton体系的最佳实验条件下，研究硒多糖和硒蛋白对羟自由基的清除作用。结果表明：硒多糖和硒蛋白清除羟自由基的效果比与之相同浓度的无机硒和相同浓度的多糖及蛋白都要明显；其中，硒多糖的最高清除率可达65.05%，而硒蛋白的最高清除率可达19.67%。

金针菇；硒多糖；硒蛋白；羟自由基

硒是人体必需的微量元素，具有多种重要的生物学功能，对人类健康有着重要意义。不同形态的硒对机体的生物活性及安全性不同[1]。有机硒比无机硒具有吸收率高、生物活性强、环境污染小等特点，因此硒的有机化研究是目前硒研究的一个热点[2-3]。由于人们目前尚不能化学合成生物有机硒，因此只能通过生物富集进行硒的有机化[4]。然而，由于生物体固有的复杂性，人们对动植物及微生物体中硒的存在形态以及各形态中硒的含量尚未完全明了，其中部分形态的生物活性和化学稳定性还有待于进一步研究[5]，致使食品硒源在提供丰富硒的同时，对其安全评价缺乏应有的理论依据。

自由基是人体生命活动中多种生化反应的中间代谢产物，羟自由基(·OH)是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种[6]。研究表明，自由基与衰老、肿瘤、心脑血管疾病、免疫系统功能减退等疾病相关[7]。因此，人们越来越认识到清除体内过剩自由基的重要性，羟自由基清除率也被作为一种物质抗氧化作用强弱的重要指标。

含硒生物大分子如硒多糖、硒蛋白是生物体将无机硒转化成有机硒的有效形式之一[8]。本实验以富硒金针菇为载体，采用现代生物分离提取技术获得天然有机含硒生物大分子，并考察其对羟自由基的清除作用，比较研究其与无机硒的生物活性，为开发天然有机硒补剂食品、研究其药理作用及生物安全性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

富硒金针菇(源于同实验组同学自行培养)。

硫酸亚铁、过氧化氢、亚硒酸钠、邻二氮菲、无水乙醇等试剂均为国产分析纯。

7500c型电感耦合等离子体质谱ICP-MS 美国Agilent公司；紫外-可见分光光度计 美国Varian公司；CLJ2000型磁力搅拌器 常州国华电器有限公司。

1.2 含硒生物大分子的提取及其组分含量的测定

在最佳浸提条件下提取硒多糖和硒蛋白[8-9]。采用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝染色法测得多糖和蛋白的含量[10]。用ICP-MS法测定硒多糖和硒蛋白中硒的含量[11]。

1.3 含硒生物大分子对羟自由基的清除作用

利用Fenton体系[12]测定含硒生物大分子对·OH的清除作用。Fe2+和H2O2反应产生·OH，由于·OH可特异地使铁-邻二氮菲褪色，根据褪色程度用比色法于510nm波长处测定·OH含量。在Fenton体系中分别加入一定浓度不同体积的有机硒试液，用去离子水定容至10.0mL。于37℃恒温水浴中反应90min，以5mm比色皿测吸光度A510nm。受试样表观羟自由基清除率按下式计算：

2 结果与分析

2.1 多糖、蛋白及硒含量的确定

图1 多糖标准曲线Fig.1 Standard curve for the determination of polysaccharides

图2 蛋白标准曲线Fig.2 Standard curve for the determination of proteins

苯酚-硫酸法测定多糖含量的标准曲线如图1所示，考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量的标准曲线如图2所示。

通过标准曲线得金针菇硒多糖中多糖的质量浓度为529.649μg/mL，金针菇硒蛋白中蛋白的质量浓度为95.83μg/mL。通过ICP-MS法测得金针菇硒多糖中硒的含量为 0.01956μg/mL，金针菇硒蛋白中硒的含量为483.81μg/g。

2.2 Fenton体系实验条件的确定

2.2.1 FeSO4、邻二氮菲及H2O2体积分数对ΔA510nm的影响

图3 FeSO4浓度对ΔA510nm的影响Fig.3 Effect of FeSO4concentration on ΔA510nm

由图3可知，随着FeSO4浓度的增加(固定H2O2体积分数及邻二氮菲浓度)，ΔA510nm也随之变大，当Fe2+浓度增至0.6mmol/L时，ΔA510nm达到最大。进一步增加Fe2+浓度，ΔA510nm反而下降，故本实验选取Fe2+浓度为0.6mmol/L。

图4 邻二氮菲浓度对ΔA510nmµ的影响Fig.4 Effect of 1,10-phenanthroline concentration onΔA510nmµ

图5 过氧化氢体积分数对ΔA510nm的影响Fig.5 Effect of H2O2concentration onΔA510nm

H2O2和邻二氮菲对ΔA510nm的影响均呈正相关，如图4、5所示。 因此选择邻二氮菲浓度和H2O2体积分数分别为1mmol/L和0.01%。

2.2.2 保温时间与ΔA510nm的关系

由于Fenton反应具有明显的动力学特征，因而在指定的反应温度下(37℃)，反应产物稳定时所需要的时间影响ΔA510nm。37℃水浴保温120min时间内，随着保温时间的延长ΔA510nm逐渐增大，90min后改变不明显，所以设定加热时间为90min(图6)。

图6 保温时间对ΔA510nm的影响Fig.6 Effect of temperature holding time onΔA510nm

2.3 含硒生物大分子对羟自由基的清除作用

根据2.2节所得实验结果，按照1.3节所述方法产生·OH的Fenton体系，分别加入已知硒含量和蛋白含量的硒蛋白、与硒蛋白中硒含量相同的亚硒酸钠、与硒蛋白中蛋白含量相同的蛋白质，使得蛋白质的含量或硒的含量在同一水平；依次加入量为1、3、5mL(相应硒含量分别为48.38、145.14、241.91μg/g)，测定体系中硒浓度由低到高的变化过程中ΔA510nm，以同样的方法对硒多糖也进行了实验，结果如图7所示。

图7 含硒生物大分子对羟自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of Se-binding biopolymers and their native counterparts on hydroxyl free radicals

由图7可知：无论是A-T组还是B-T组，随硒浓度的增加，A510nm都在增加；但硒蛋白(硒多糖)的增加比单纯无机硒和普通金针菇蛋白(普通金针菇多糖)的增加对A510nm的影响大。对于同一加入量，两组中无机硒和蛋白(多糖)溶液的A510nm无显著差异，但硒蛋白(硒多糖)的A510nm却存在显著差异。对于从富硒金针菇中提取的两种含硒生物大分子，随着硒浓度的增加，硒多糖

A510nm增加的幅度明显高于硒蛋白。

2.4 清除率的测定

图8 硒多糖、普通多糖及亚硒酸钠对·OH的清除率Fig.8 Scavenging effects of Se-binding polysaccharides, pure polysaccharides and Na2SeO3on hydroxyl free radicals

图9 硒蛋白、普通蛋白及亚硒酸钠对·OH的清除率Fig.9 Scavenging effects of Se-binding protein, pure protein and Na2SeO3on hydroxyl free radicals

无论是低质量浓度组还是高质量浓度组，富硒金针菇中的硒多糖或硒蛋白对·OH的清除率均显著高于普通多糖(蛋白)以及亚硒酸钠，如图8、9所示，说明硒增强了多糖或蛋白消除·OH的活性，硒多糖或硒蛋白都比无机硒补剂具有更高的抗氧化作用；此外，在各质量浓度组中，硒蛋白对·OH的清除率要远远高于普通蛋白和亚硒酸钠对·OH的清除率之和，当硒多糖的加入量为5mL时，硒多糖对·OH的清除率要大于普通多糖和亚硒酸钠的加和，说明硒与食用菌蛋白或多糖之间在清除·OH方面存在着协同作用，此作用可使硒多糖的最高清除率达65.05%，硒蛋白的最高清除率达19.67%；实验还发现，对于亚硒酸钠而言，当它的质量浓度达到一定值时，随着质量浓度的增加其清除效果会基本保持不变甚至有所降低，说明高质量浓度的亚硒酸钠抑制了硒对·OH的清除作用，以亚硒酸钠形式存在的硒在相同的硒水平下表现出硒的中毒现象。

2.5 硒多糖与硒蛋白对羟自由基清除作用比较

由图8、9可知，同一加入量的硒多糖清除·OH的效果明显的好于硒蛋白，将不同含硒量的硒多糖和硒蛋白对·OH的清除效果比较如图10所示，结果表明，欲达到同样的清除效果，所需硒多糖中硒的含量远远低于硒蛋白中硒的含量，说明富硒金针菇中的硒多糖对·OH的清除效果、抗氧化性、生物活性要明显好于硒蛋白。这也表明，在金针菇中与多糖结合的硒是主要存在形态，说明有机硒水平的高低直接影响着对·OH的清除效果。

图10 硒多糖与硒蛋白对羟自由基清除作用的比较Fig.10 Comparison of hydroxyl free radical scavenging effects between Se-binding polysaccharides and Se-binding proteins

3 结 论

通过生物富集培育的富硒金针菇含有大量的有机硒，其主要化学形态为硒多糖和硒蛋白，实验表明，有机硒多糖和硒蛋白相对无机硒具有更好的清除·OH、抗氧化活性作用，而且在富硒金针菇中硒多糖比硒蛋白的这种生物活性更强。这些含硒生物大分子化合物作为一种天然无毒高效的·OH清除剂，无论是对拮抗或抑制体内过量自由基的产生，还是增强机体免疫活性方面，都是难得的有机硒源，以金针菇为富硒载体具有广阔的应用前景。

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Scavenging Effect of Selenium-rich Flammulina velutipes on Hydroxyl Free Radicals

LI Hua-wei1，ZHAO Su-yun2，TIE Mei2,*
(1. College of Chemistry and Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China；2. School of Environmental Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China )

The fruit bodies of selenium-rich Flammulina velutipes were extracted by modern separation techniques to obtain Se-binding polysaccharides and Se-binding proteins. Phenol-sulfuric acid method, ICP-MS and Coomassie brilliant blue G-250 dye method were used for the quantifications of polysaccharides, selenium and proteins, respectively. The scavenging effects of the Se-binding polysaccharide extract and the Se-binding protein extract on hydroxyl free radicals generated in a Fenton system were evaluated under optimal experimental conditions. It was found that the hydroxyl free radical scavenging effects of Sebinding polysaccharides and Se-binding proteins were more obvious than those of inorganic selenium, pure polysaccharides or pure proteins at the same concentrations. The maximum scavenging rates of Se-binding polysaccharides and Se-binding proteins on hydroxyl free radicals were 65.05 % and 19.67%, respectively.

Flammulina velutipes；Se-binding polysaccharides；Se-binding proteins；hydroxyl free radicals

TS255.1

A

1002-6630(2010)17-0018-04

2010-01-07

国家自然科学基金项目(20611130317/B01)；辽宁省教育厅科学技术研究项目(2008227)

李华为(1962—)，男，副教授，硕士，研究方向为分析化学。E-mail：lhw62515@126.com

*通信作者：铁梅(1964—)，女，教授，博士，研究方向为天然有机食品生物化学。E-mail：tiemei07@yahoo.cn