苦瓜皂苷对成骨细胞增殖和ALP的影响

2010-03-23杨志刚沈宗根张燕萍

食品科学 2010年23期

关键词：溶媒苦瓜成骨细胞

杨志刚，沈宗根，张燕萍

(常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500)

苦瓜皂苷对成骨细胞增殖和ALP的影响

杨志刚，沈宗根，张燕萍

(常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500)

研究苦瓜皂苷对体外培养的新生SD 乳鼠成骨细胞增殖和ALP的影响。以1×10-8～1×10-4mol/L浓度梯度的苦瓜皂苷的MEM含药培养液对新生 SD乳鼠24h内颅盖骨进行体外细胞培养，分别用 MTT法和 PNPP法检测成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。结果表明：苦瓜皂苷具有时间和剂量依赖性地促进成骨细胞增殖和提高成骨细胞 ALP活性。

苦瓜皂苷；成骨细胞；ALP

苦瓜(Mo mord ica charanti a L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)苦瓜属植物，又称癞葡萄和锦荔枝，属蔓性一年生蔬菜。《本草纲目》记载：苦瓜“苦寒、无毒、除邪热、解劳乏、清心明目、益气壮阳”。皂苷是苦瓜中的主要活性成分。化学研究表明，苦瓜皂苷主要属于四环三萜类葫芦素烷型皂苷，由皂苷元和低聚糖构成，具有降血糖、抗氧化、提高免疫能力、提高雌激素水平、抗肿瘤、抗艾滋病毒等生理功能[1-5]。近期研究表明苦瓜皂苷具有防治骨质疏松症的药理作用[6]，为研究其作用机理，本实验利用体外成骨细胞培养技术观察苦瓜皂苷对成骨细胞增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

新生SD乳鼠，清洁级，苏州大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2007-0035。

苦瓜皂苷(粉末，纯度98%) 南京泽朗医药科技有限公司；VD3上海通用药业股份有限公司；新生牛血清(NCS)、MEM培养基 Invitrogen 公司；胰酶、Ⅱ型胶原酶、二甲基亚砜(D M S O)、四甲基偶氮唑蓝(MTT) Sigma公司；ALP试剂盒、TritonX-100 南京建成生物技术公司。

CO2培养箱 Shellab公司；倒置相差显微镜 Nikon公司；UV-2450紫外-可见分光光度计岛津公司；酶标仪 Thermo 公司；培养板 Costar公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

苦瓜皂苷和VD3分别溶于DMSO中，用对比稀释法配制成含12%小牛血清的MEM含药培养液，药物终含量分别为：溶媒对照中DMSO 0.01%；苦瓜皂苷组中皂苷含量分别为1×10-8、 1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L；VD3组中VD3含量为1×10-6mol/L。

1.2.2 成骨细胞分离与培养[7-8]

取新生 SD乳鼠 5只(24h内)，75%酒精浸泡 5min，无菌取颅盖骨，置 D-hanks液中，剔除干净黏附的结缔组织和血管，D-hanks液再次冲洗，放入小瓶中剪碎约1mm3，将骨片移入5mL 0.25%胰蛋白酶溶液，37℃预消化25min，将骨片移入5mL 0.1% II型胶原酶溶液中消化，37℃水浴振荡，60次/min，45min×2次，将含细胞的消化液1000r/min离心10min，弃上清液，PBS清洗，加入含12%小牛血清的MEM培养液，将沉淀的细胞团块用培养液制成细胞悬液，混匀计数，按需要密度接种于培养瓶，置5% CO2培养箱37℃孵育，48h后换液，2～3d换液 1次，贴壁率达 80%～90%及时传代。

1.2.3 成骨细胞传代

原代细胞培养液加4mL D-Hanks液，漂洗，弃液，加2.5mL 0.25%的胰蛋白酶消化，约4min左右，肉眼观察薄膜现象，相差倒置显微镜观察细胞间隙变大回缩时弃胰酶消化液，加入6mL含12%小牛血清的MEM培养液，吹打细胞层呈片状从瓶壁脱落，相差倒置显微镜观察细胞变圆，按1:3瓶比例传代，置于37℃、5% CO2培养箱培养。

1.2.4 MTT法测定成骨细胞增殖

参照文献[9]记录方法，采用第2代成骨细胞消化后制成1×105个/mL的细胞悬液，96孔培养板每孔100μL培养，24h后弃原培养液，按1.2.1节方法分组，分别加含不同药液血清培养液100μL，放置5% CO2培养箱37℃继续培养，分别在24、48、72h结束前4h PBS冲洗，更换无血清的MEM培养液，同时加入5mg/mL MTT溶液10μL孵育4h，弃上清液，加100μL酸化的10% SDS过夜，酶标仪570nm波长处比色检测细胞增殖OD值。

1.2.5 KAPLOW氏法观察成骨细胞分化

参照文献[10]记录方法，选用第2代成骨细胞消化后制成1×105个/mL的细胞悬液，以2mL细胞悬液接种于6孔培养板，24h后换液。将含12%小牛血清含药MEM培养液分别加入内置有盖玻片的6孔板内。含药培养液的药物终含量分别为：溶媒对照组DMSO 0.01%、苦瓜皂苷组1×10-4mol/L、VD3组1×10-6mol/L，2d换含药培养液一次，放置5% CO2培养箱37℃继续培养，6d后进行ALP染色，100倍倒置显微镜观察。

1.2.6 PNPP法测定成骨细胞ALP活性

参照文献[10] 记录方法，选用第2代成骨细胞消化后制成1×105个/mL的细胞悬液，24孔培养板每孔1mL培养，24h后弃原培养液，按1.2.1方法分组分别加含不同药液血清培养液1mL，放置5% CO2培养箱37℃继续培养，分别于2、3、6d后取出，PBS冲洗，每孔加0.25mL 0.1%的Triton-100溶解细胞膜，10min后按ALP测定试剂盒说明书进行ALP比活性测定。

1.2.7 统计学分析

2 结果与分析

2.1 成骨细胞鉴定

培养第1天可见细胞数量较多悬浮在培养液中，呈圆形，核大而圆位于胞体的一端；24h后细胞全部贴壁，胞体展开呈三角形、多角形、梭形等，核呈卵圆形；对数生长期细胞分裂相多见，有较多的突起互相连接；细胞汇合时呈铺石状，并可重叠生长，符合成骨细胞形态学特征。碱性磷酸酶染色，酶活动处呈亮红颗粒，ALP测定培养液有较高的ALP活性，符合成骨细胞功能学特征。

2.2 苦瓜皂苷对成骨细胞增殖的影响

表1 苦瓜皂苷对新生大鼠颅盖骨成骨细胞增殖的影响(±s，n=5)Table 1 Effect of treatment withMomordica charantiaL. saponins for different hours on the proliferation ofin vitrocultivated osteoblasts in neonatal rat calvaria (±s，n=5)

注：*.与溶媒对照组相比，有显著性差异(P＜0.05)；**.与溶媒对照组相比，有极显著性差异(P＜0.01)。

药物浓度/(mol/L)OD570nm24h48h72h溶媒对照组0.103±0.0180.189±0.0180.218±0.045 1×10-80.105±0.0190.190±0.0160.320±0.048 1×10-70.124±0.0290.195±0.0140.322±0.054苦瓜皂苷组1×10-60.131±0.0270.205±0.0200.364±0.118* 1×10-50.146±0.0380.241±0.039*0.372±0.065** 1×10-40.152±0.022*0.261±0.025**0.395±0.098** VD3组1×10-60.203±0.032**0.268±0.045**0.347±0.058**

由表1可见，苦瓜皂苷作用24h后，1×10-4mol/L浓度组对培养成骨细胞具有促增殖作用，与溶媒对照组比较有统计学意义(P＜0.05)。作用48h后，1×10-5mol/L和1×10-4mol/L 浓度组促增殖作用较为明显，与溶媒对照组比较有显著差异(P＜0.05 或P＜0.01)。作用72h后，在1×10-6～1×10-4mol/L浓度范围内对培养成骨细胞均表现出促增殖作用，与溶媒对照组比较，苦瓜皂苷对成骨细胞的增殖作用具有明显的统计学意义(P＜0.05 或P＜0.01)。

2.3 苦瓜皂苷对成骨细胞ALP的影响

由图1 KAPLOW氏法染色细胞图片可见，与未染色组比较，溶媒对照组成骨细胞经ALP染色后可见有红色，但偶见红色颗粒；经苦瓜皂苷作用后，成骨细胞ALP染色呈片状的红色，且有较多的红棕色颗粒着色；VD3组成骨细胞，经ALP染色后呈弥散的红色，也有一定的红棕色颗粒着色。

图1 新生大鼠颅盖骨成骨细胞KAPLOW氏法染色细胞涂片(×100)Fig.1 KAPLOW staining observations of rat osteoblasts treated and untreated withMomordica charantiaL. saponins (×100)

表2 苦瓜皂苷对新生大鼠颅盖骨成骨细胞ALP活性的影响(±s，n=3)Table 2 Effect of treatment withMomordica charantiaL. saponins for different hours on ALP activity ofin vitrocultivated osteoblasts in neonatal rat calvaria (±s，n=3)

注：*.与溶媒对照组相比，有显著性差异(P＜0.05)；**.与溶媒对照组相比，有极显著性差异(P＜0.01)。

药物浓度/(mol/L)成骨细胞ALP活性2d3d6d溶媒对照组0.143±0.0380.149±0.0280.178±0.034 1×10-80.175±0.0390.169±0.0320.203±0.043 1×10-70.194±0.0280.204±0.0440.312±0.105*苦瓜皂苷组1×10-60.235±0.0470.297±0.065*0.323±0.78** 1×10-50.279±0.048*0.334±0.049**0.389±0.053** 1×10-40.325±0.052**0.351±0.085**0.487±0.071** VD3组1×10-60.287±0.053**0.329±0.055**0.347±0.068**

由表2 PNPP法定量分析结果可见，新生大鼠颅盖骨成骨细胞在苦瓜皂苷培养条件下，其分泌的ALP活性随着培养时间的延长而逐渐增强。苦瓜皂苷作用2d后，在1×10-5～1×10-4mol/L 浓度范围内培养的成骨细胞，与溶媒对照组比较，其ALP活性增强(P＜0.05或P＜0.01)。作用3d后，以1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L浓度培养成骨细胞，与溶媒对照组比较，其ALP活性增加明显(P＜0.05 或P＜ 0.01)。作用6d后，苦瓜皂苷各组ALP活性升高明显，尤以1×10-7、1×10-6、1×10-5、1× 10-4mol/L 浓度范围培养的成骨细胞作用更显著，与溶媒对照组比较呈现显著的促进作用(P＜0.05 或P＜0.01)。

3 结论

3.1 成骨细胞具有合成、分泌组成骨基质的胶原和糖蛋白的作用，在维持机体内环境稳定，生理机制调节和骨代谢疾病中发挥主要作用。目前，评定促进骨细胞功能药物的主要药效指标有骨细胞增殖评定，ALP测定等。MTT比色法是由Mosman建立的一种快速测定细胞增殖的方法，能反映细胞内的DNA合成状态[11]。本研究MTT实验结果表明，苦瓜皂苷在1×10-4mol/L浓度培养成骨细胞24h，与溶媒对照组比较具有促细胞增殖作用，作用时间延长至48h和72h促增殖作用更明显，表明苦瓜皂苷对成骨细胞具有促增殖作用，且具有时间和剂量依赖性。

3.2 新生大鼠颅盖骨成骨细胞经ALP重氮盐法(改良KAPLOW氏法)染色后，镜下成骨细胞呈现红色着色，与未染色成骨细胞镜下所见差异明显，表明所培养的细胞确为成骨细胞。ALP是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，特异性高，为成骨细胞分化成熟的主要标志之一。ALP在细胞中表达的多少，能合理地反映成骨细胞的分化程度和功能状态，当成骨细胞活动增强时，ALP活性升高，ALP活性的高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志。本研究显示，与溶媒对照组相比较，苦瓜皂苷组新生大鼠颅盖骨成骨细胞经ALP重氮盐法(改良KAPLOW氏法)染色后，ALP染色呈片状的红色，且有较多的红棕色颗粒着色，表明苦瓜皂苷具有促进成骨细胞分泌ALP的功能，进一步的定量研究结果表明苦瓜皂苷具有时间和剂量依赖性地增加成骨细胞分泌ALP的作用。

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Effect of Momordica charantia L. Saponins on Osteoblast Proliferation and Alkaline Phosphatase Expression

YANG Zhi-gang，SHEN Zong-gen，ZHANG Yan-ping
(College of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

The present study was aimed at investigating the effect of Momordica charantia L. saponins on the proliferation and alkaline phosphatase (ALP) expression of in vitro cultivated osteoblasts of new born neonatal SD rats. The in vitro cultivation of new born SD rat (aged within 24 h) osteoblast at gradient concentrations of Momordica charantia L. saponins in MEM medium was performed, and MTT and PNPP assays were used to measure the proliferation and ALP activity of osteoblasts, respectively. Our findings suggest that Momordica charantia L. saponins promote the proliferation and ALP activity of osteoblasts in timeand dose-dependent manners.

Momordica charantia L. saponins；osteoblast；ALP

R965 ；Q946.83

1002-6630(2010)23-0383-03

2010-11-23

常熟理工学院青年教师科研启动基金项目(QZ0811)

杨志刚(1977—)，男，实验师，硕士，主要从事药用植物活性成分药理研究。E-mail：zgy@cslg.cn