麦芽糖转糖基酶在毕赤酵母中的表达及活性分析

朱国强，王水兴*，黄 兰，朱石龙

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

麦芽糖转糖基酶在毕赤酵母中的表达及活性分析

朱国强，王水兴*，黄 兰，朱石龙

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

用PCR方法从E.coli BL21(DE3)中获得麦芽糖转糖基酶基因，将该基因插入到酵母表达载体pPIC9K的α分泌信号开放阅读框的下游，对重组质粒pPIC9K-MalQ所含的外源片段进行双向测序。将测序正确的重组质粒用内切酶SalⅠ线性化，电穿孔转化到GS115感受态细胞中，G418梯度筛选高拷贝转化菌及PCR鉴定目的基因的整合，1%甲醇诱导表达。经薄层色谱分析粗酶液处理的麦芽二糖溶液，证实粗酶液具有麦芽糖转糖基酶活性。

麦芽糖转糖基酶；毕赤酵母；基因重组

麦芽糖转糖基酶(amylomaltase)存在于古生菌[1]、细菌[2]及一些植物[3-4]中，参与麦芽糖的代谢利用[5]，淀粉为底物生成热可逆性凝胶或环状糊精[6]。热可逆性凝胶可以取代明胶，有效地解决淀粉回生问题；环状糊精具有筒状疏水内腔和亲水外表，可以和多种疏水性客体分子形成包合物，从而改变客体分子的水溶性、稳定性、反应性，因此环状糊精可应用于食品、化学及医药工业。由此可见，这两种物质都具有很好的商业应用价值。

现在工业中所用的环状糊精主要是聚合度分别为6、7、8的α-、β-、γ-环糊精及其衍生物，其中以β-环糊精应用最为广泛。而大环糊精是指一种聚合度(指葡萄糖分子的数目)从9到几百不等的环状葡聚糖，比α-、β-、γ-环糊精具有更大的筒状内腔，包合能力更强，可以包合多种分子质量的分子[7]，且大环糊精具有高水溶性。由于大环糊精可以与更多的疏水性物质形成包合物，因而应用范围更广。麦芽糖转糖基酶是合成大环糊精的一种酶，具有催化分子间和分子内的糖基转移作用，反应式如下：

(α-1,4 glucan)m+(α-1,4 glucan)n→(α-1,4 glucan)m-x+ (α-1,4 glucan)n+x(1) (α-1,4 glucan)n→cyclic(α-1,4 glucan)x+(α-1,4 glucan)n-x(2)

在反应式(2)中，麦芽糖转糖基酶可以把直链淀粉环化成含10～50个葡萄糖残基的大环糊精[8-12]。Terada等[10]在E.coli中成功表达了来自Thermus aquaticus ATCC 33923的麦芽糖转糖基酶基因(MalQ基因)，将获得的酶作用于直链淀粉，证实了该酶能催化分子内的糖基转移而生成大环糊精。

本研究从E.coli BL21(DE3)中克隆得到MalQ基因，构建了毕赤酵母分泌型表达菌株，重组菌经培养和诱导表达后，提取粗酶液，薄层色谱检测表明，粗酶液具

有麦芽糖转糖基酶活性，旨在为利用麦芽糖转糖基酶来制备大环糊精及应用该酶生产热可逆性凝胶提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宿主菌与质粒：E.coli BL21(DE3)与E.coli DH5α本实验室保存，毕赤酵母菌株GS115与质粒pPIC9K由南昌大学的黄国俊教授提供。

pfu DNA聚合酶、T4DNA 连接酶、限制性内切酶(Not Ⅰ、EcoRⅠ、SalⅠ) TaKaRa公司(大连)。引物(UP 5＇CGGAATTCATGGAAAGCAAACGTCTGG 3＇，下划线为EcoRⅠ酶切位点；LP 5＇ATAAGAATGCGGC CGCGCATCAACCGCACTCTACT 3＇，下划线为Not Ⅰ酶切位点) 上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 仪器与设备

Gene Amp PCR system 2400型 PCR扩增仪 美国PE公司；FR-2000凝胶成像系统 上海夏日科技有限公司；DYY-Ⅲ型稳压电泳仪 北京六一仪器厂；Bio-Rad电转仪 Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR扩增MalQ基因

根据GenBank中报道的E.coli BL21(DE3)的MalQ基因序列，用Olige6.0软件设计带有与pPIC9K 的MCS上相同酶切位点的引物，并以E.coli BL21(DE3)基因组DNA为模板，扩增MalQ基因。PCR扩增程序：98℃5min；98℃ 10s，60 ℃ 5s，72℃ 2.5min，共30个循环；72℃ 10min。

1.3.2 pPIC9K-MalQ重组质粒的构建

将PCR产物和pPIC9K质粒用EcoRⅠ及Not Ⅰ双酶切，琼脂糖电泳回收纯化，用T4DNA ligase进行连接反应，连接产物热休克转化菌E.coli DH5α，培养于氨苄青霉素的LB平板上，挑取阳性克隆子，提取质粒，酶切鉴定含有MalQ基因的重组子送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.3.3 酵母菌的转化和高拷贝整合菌株的筛选

在80μL酵母GS115感受态细胞中加入用SalⅠ线性化的重组质粒DNA 10μL(约5～20μg)，迅速加入冰预冷的0.2cm电击杯中，在冰上放置5min，根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击，迅速加入1mL预冷的山梨醇，将内容物转移至灭菌的1.5mL离心管中，取200μL涂布于MD平板，30℃培养至克隆产生。再将MD平板上生长的阳性克隆分别转种至G418质量浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0g/L的YPD平板上，在高质量浓度YPD-G418平板上生长的菌落为高拷贝整合菌株[13]。

1.3.4 高拷贝整合菌株的PCR鉴定

挑取高拷贝整合单菌落接种于10mL YPD培养基中，30℃培养18h，采用反复冻融法[14]制备酵母PCR模板，用UP和LP引物进行PCR扩增，PCR条件与1.3.1节相同。

1.3.5 工程菌株的诱导表达

将PCR鉴定为阳性的菌株，接种于25mL BMGY培养基中，28℃、200r/min培养至OD600nm为5～6，4000r/min离心收集菌体，加入20mL BMGY重悬培养，每隔2h加入终体积分数为1%的甲醇诱导表达。

1.3.6 酶活力测定

采用葡萄糖氧化酶法测定酶活，10μL反应液加入1mL葡萄糖测定试剂盒工作液，37℃水浴15min后，于505nm波长处测定吸光度，参照葡萄糖含量-吸光度标准曲线可求酶活，具体操作见葡萄糖测定试剂盒说明书(上海荣盛生物技术有限公司)。

1.3.7 TLC分析糖基转移酶活性

取粗酶液100μL加入到900μL 1g/100mL的麦芽二糖溶液中，37℃温育30min，100℃水浴5min灭酶活，12000r/min离心5min，上清用TLC分析，以正丁醇-乙酸-蒸馏水(体积比5:4:11)为展开剂，浓硫酸-乙醇(体积比1:1)为显示剂，喷雾显色剂后，120℃烘烤10min。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增MalQ基因

经PCR扩增，电泳验证获得约2.1kb的基因片段，与目的基因片段大小一致，结果见图1。

图1 目的片段PCR扩增结果(目的片段约2.1kb)Fig.1 PCR amplification ofMalQ gene

2.2 pPIC9K-MalQ重组质粒的获得及电泳验证

将PCR产物和pPIC9K质粒用EcoRⅠ及Not Ⅰ双酶切，琼脂糖电泳回收纯化，用T4DNA ligase进行连接反应，连接产物热休克转化菌E.coli DH5α，培养于氨苄青霉素的LB平板上。

挑取氨苄青霉素平板上的阳性克隆质粒，双酶切得到两条条带，一条与目的片段大小相符，另一条与质粒pPIC9K分子质量相符，由此可以初步判断获得了阳

性重组质粒。将酶切验证正确的阳性克隆送上海生工测序，测序结果经BLAST比对，与GenBank中报道的E.coli BL21(DE3) MalQ基因的同源性为100%。重组质粒双酶切结果见图2。

图2 阳性重组质粒双酶切分析Fig.2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pPIC9KMalQ

2.3 GS115的转化和高拷贝整合菌株的筛选

SalⅠ线性化的pPIC9K-MalQ质粒转化GS115感受态细胞，在MD平板上培养3d，共得到47个His＋转化菌落，与空载体的转化效率没有明显差别。将pPIC9K-MalQ转化的His＋菌落、空载体转化菌和GS115逐个点种至不同质量浓度的YPD-G418平板上，在0.25g/L YPD-G418的平板上所有His＋菌生长无差异，GS115生长缓慢；而当G418质量浓度在0.5、1.0、2.0g/L时，GS115不生长，His＋菌生长速度出现差异；4.0g/L的YPD-G418平板上无His＋菌生长。在2.0g/L的YPD-G418平板上共得到4个生长速度较快的大菌落，估计是高拷贝菌株。

2.4 PCR鉴定高拷贝整合菌株

挑取在2.0g/L YPD-G418平板上生长的4个菌落，经原位PCR验证，均扩增得到分子质量为约2.1kb大小的片段，表明MalQ基因已成功整合到毕赤酵母的染色体中，PCR结果见图3。

图3 PCR鉴定目的基因的整合Fig.3 PCR identification of target gene integration

2.5 酶活力测定

一个酶活力单位定义为在如下反应条件中每分钟产生1 μ mol/L的葡萄糖所需的粗酶液量。于900 μ L 1g/100mL的麦芽二糖溶液中加入100μL粗酶液，37 ℃反应30min，反应结束后沸水浴10min灭活酶，反应产生的葡萄糖采用葡萄糖氧化酶法测定，得粗酶液的酶活为118U。

2.6 麦芽糖转糖基酶活性分析

用1g/100mL的麦芽糖与粗酶液在37℃反应30min，经高速离心处理，上清经薄层分析，结果见图4，可以看出当以麦芽糖为底物时，由基因工程菌诱导表达得到的粗酶液能够将糖基转移生成葡萄糖、麦芽三糖、四糖、五糖，证明粗酶液具有麦芽糖转糖基酶活性。

图4 薄层分析酶促反应液Fig.4 TLC analysis of enzymatic reaction mixture

3 讨 论

麦芽糖转糖基酶是作用于淀粉生产热可逆性凝胶和环状糊精关键酶制剂，在食品、化工及医药行业具有很好的开发前景。麦芽糖转糖基酶具有催化分子内的糖基转移作用，使直链淀粉环合生成大环糊精，近年来，越来越多的科学家利用麦芽糖转糖基酶的这一作用，开展大环糊精的制备研究。但该酶在微生物和一些植物中的含量很低，直接提取该酶都难以满足研究和应用的要求，必须通过基因工程技术来表达该酶。一些麦芽糖转糖基酶基因已在大肠杆菌中得到表达，以大肠杆菌作为宿主表达麦芽糖转糖基酶，虽然发酵时间短，表达水平较高，但表达产物通常以包涵体的形式存在[15]，无活性，不利于工业化生产。本实验首次采用毕赤酵母表达麦芽糖转糖基酶，毕赤酵母作为真核生物，不仅具有其他高等真核表达系统的许多优点，如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等，且操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单，通过将麦芽糖转糖基酶基因插入到含有AOX1基因启动子和α分泌信号肽的毕赤酵母表达载体pPIC9K中，转化入表达宿主菌GS115，G418梯度筛选转化菌，从而得到整合了多拷贝基因的工程菌，甲醇诱导表达，表达产物可以直接分泌到培养液中，经薄层色谱分析，证实培养液具有麦芽糖转糖基酶活性。因毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，所以分泌的外源蛋白

是培养基中蛋白的主要成分，有利于蛋白的纯化，比大肠杆菌融合表达的蛋白纯化更加方便，因此利用毕赤酵母表达麦芽糖转糖基酶，为工业化生产和纯化该酶提供了极大的方便，也为大环糊精的制备打下了基础。

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Expression and Activity Assay of Amylomaltase in Pichia pastoris

ZHU Guo-qiang，WANG Shui-xing*，HUANG Lan，ZHU Shi-long
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047,China)

The gene of MalQ was amplified from genomic DNA of E. coli BL21(DE3) and subcloned intoα secretion signal open reading frame of pPIC9K expression vector to obtain a recombinant plasmid pPIC9K-MalQ. The recombinant plasmid was verified by DNA sequence. The resultant recombinant plasmid bearing MalQ gene was digested by Sal I and transformed into Pichia pastoris strain GS115. The cells with stable expression of amylomaltase were screened in the medium containing G418. The positive clones were induced with methanol to express amylomaltase. The activity of 4-α-glucanotransferase in the crude enzyme was validated through TLC.

amylomaltase；Pichia pastoris；gene recombination

Q786

A

1002-6630(2010)23-0258-04

2010-08-14

朱国强(1984—)，男，硕士研究生，研究方向为分子生物学。E-mail：zhuguo0716@yahoo.com.cn

*通信作者：王水兴(1965—)，男，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：shuixingw@yahoo.com.cn