香青兰提取物对体外培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

赵 杰,薛文华,梁淑红

1)郑州大学第一附属医院药剂科郑州 450052 2)新疆维吾尔自治区药物研究所乌鲁木齐 830004△男,1969年5月生,博士,副主任药师,研究方向:临床药理学,E-mail:zhaojie@zzu.edu.cn

唇形科植物中的香青兰分布于我国东北、西北及华北等地区,特别是新疆,资源丰富。香青兰药用全草为地上干燥部分,气清香,叶微辛。香青兰在民间用于治疗冠心病及血液质旺盛(高血压)、寒性神经性头痛等疾病,疗效确切。冠心病是常见病和多发病,心绞痛为本病的主要症状之一。研究[1]发现,香青兰二级温热,有很强的香味,具有补益心脑、活血化淤、通路开窍及止痛解毒之功效,全方位针对治疗冠心病和心绞痛的综合症状,确实能改善心肌缺血的状况。为了进一步开发利用香青兰,作者分别对香青兰进行了系统分层溶剂萃取,分别得到总提取物层、氯仿层、乙酸乙酯层和正丁醇层,然后用体外培养的乳鼠心肌细胞制备缺氧/复氧(hypoxia/ reoxygenation,H/R)损伤模型,观察香青兰不同提取部位对心肌细胞损伤的影响并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 香青兰由新疆民族药研究所提供;NaCl与KCl(天津市福晨化学试剂厂)、KH2PO4、Na2HPO4、NaHCO3、NaH2PO4、MgSO4、CaCl2和NaHCO3(天津市化学试剂三厂);EDTA、二甲基亚砜、MTT、DMEM培养粉(高糖、低糖)和胰蛋白酶(美国Amresco公司);胎牛血清、链霉素(华北制药股份有限公司);注射用氨苄西林钠(中诺药业有限公司);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(美国Gibco公司)。超声细胞破碎仪(上海新芝生物技术研究所与宁海新芝科研所生产),酶联免疫检测仪(美国Coulter公司生产)。

1.2 香青兰有效成分的提取 香青兰全草500 g,粉碎,分别用体积分数为 95%的乙醇回流提取 2次和体积分数 50%的乙醇回流提取 1次,料液体积比1:10,每次 2 h,合并 3次的提取液,减压浓缩回收溶剂得浸膏 150 g。再对浸膏进行分层萃取,具体流程参考文献[2]。

1.3 乳鼠心肌细胞原代培养[3]取出生 1～3 d的SD大鼠乳鼠(雌雄不限,由河南省实验动物中心提供)。无菌条件下取出心脏后用冷PBS溶液洗净心脏内残血,将心肌剪碎成 1 mm3左右的小块,用培养基冲洗2～3次后,置组织于2.5 g/L胰蛋白酶中37℃分次消化,每次 10m in,收集上清液并用冷的体积分数 10%的胎牛血清终止消化,反复吹打使细胞游离。消化液移入消毒的刻度离心管中, 1 000 r/min离心10 min,收集心肌细胞,用含体积分数10%胎牛血清的DMEM悬浮,在37℃体积分数5%CO2孵箱中培养90min。以差速贴壁法去除已贴壁的成纤维细胞和其他杂质,将细胞悬液接种于培养瓶中,在 37℃体积分数5%的CO2条件下密闭培养,24 h后更换全部的培养液,以后每 2～3 d更换培养液 1次,于试验前 1 d换成无血清的培养基,待细胞处于对数生长期的时候开始实验。

1.4 H/R损伤模型的建立[4]不含胎牛血清的低糖DMEM培养液用体积分数99.9%氮气饱和30 min后,置换培养瓶中的正常含体积分数 10%胎牛血清的DMEM培养液,再向瓶内充氮气(1 L/m in) 90 s,以驱除瓶内氧气。然后塞紧瓶塞,密闭培养 2 h后,换用经体积分数 5%CO2饱和的含体积分数10%胎牛血清正常含糖DMEM培养液,在正常培养条件下培养30 min,建立H/R模型。

1.5 实验分组 将培养的细胞于加药前 1 d移入96孔板,并分为 6组(每组 10孔)。①正常对照组含体积分数10%的胎牛血清DMEM培养液培养4 h。②模型组:缺氧 2 h,复氧30 min。③总提取物组。④氯仿组。⑤乙酸乙酯组。⑥正丁醇组。各提取物组均在H/R后 1 h后加入相应提取物,然后置于37℃,体积分数5%CO2培养箱中24 h。

1.6 观测指标

1.6.1 细胞的存活情况 心肌细胞悬浮液以2× 106mL-1的密度接种于 96孔板,用含体积分数 10%的胎牛血清培养 24 h后,用缓冲液冲洗2遍,后加入培养基和香青兰的不同提取物,从单纯培养液作对照,在37℃体积分数5%的CO2培养箱中密闭培养24 h后,每孔加20μL的MTT,37℃孵育4 h,吸去上清液,每孔加二甲基亚砜 100μL,振荡数分钟使其充分混匀,在酶联检测仪上于570 nm处测定吸光度(A)值。

1.6.2 细胞活力 取少量心肌细胞悬液以0.4%的台盼蓝染料染色,着色细胞为死细胞,而活细胞拒染,在倒置显微镜下,用血球计数板分别计活细胞的数目和死细胞数。根据下式求细胞活力:细胞活力=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

1.6.3 LDH活性 收集各组培养基,严格按照试剂盒说明书测定LDH释放量。

1.6.4 细胞内MDA和SOD含量测定 MDA的测定采用硫代巴比妥酸显色法,SOD的测定采用黄嘌呤氧化酶法,操作严格执行试剂盒说明书步骤。

1.7 统计学处理 采用SPSS 10.0进行分析,各组所有数据经正态性检验方差齐性检验;然后采用单因素方差分析及LSD-t检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 香青兰提取物对H/R损伤的心肌细胞活力的影响 各组细胞活力和吸光度值均服从正态分布且总体方差齐,因此采用单因素方差分析,结果见表1。

表1 香青兰提取物对H/R损伤心肌细胞活力的影响

2.2 香青兰提取物对H/R损伤心肌细胞LDH、MDA和SOD活性的影响 各组LDH、MDA和SOD数据均服从正态分布且总体方差齐,因均采用单因素方差分析,结果见表 2。

表2 香青兰提取物对H/R损伤心肌细胞LDH、M DA和SOD指标活性的影响

3 讨论

在细胞水平上,常以乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型模拟在体心肌缺血/再灌注损伤。作者在大鼠乳鼠心肌细胞原代培养的基础上,构建了心肌细胞H/R损伤的模型,心肌细胞缺氧 2 h,后复氧 30 min后,搏动减弱甚至停止,脂质过氧化反应增强,心肌细胞这些结构和功能的改变与心脏缺血/再灌注损伤几乎一致,可以较为真实的模拟缺血/再灌注损伤的病理生理过程[5]。

SOD是重要的抗氧化酶,其活性的高低反映心肌细胞抗氧化损伤的能力,MDA则是生物膜脂质过氧化反应的产物,其含量的变化反应生物膜是否遭到过氧化损伤。缺氧时心肌细胞膜损伤,细胞膜的完整性遭到破坏,导致膜流动性下降,通透性增加,心肌细胞LDH将大量外漏。因此,测定细胞内SOD活性、MDA含量和培养液LDH的释放量可以反映细胞的受损程度。

作者的结果显示:缺氧/复氧模型组与正常组比较,SOD活性下降,MDA含量、LDH活性明显增加,提示造模成功;香青兰不同提取物给药组与H/R模型组比较,SOD活性升高,MDA含量、LDH活性降低,说明香青兰提取物具有抑制H/R所引起的脂质过氧化反应,保护心肌细胞膜结构完整性的作用。氯仿组和乙酸乙酯组SOD活性升高,MDA含量、LDH活性降低,其他组之间相比较而言差异显著,总提取物组与正丁醇组对此没有明显的作用。此外,该研究香青兰氯仿组和乙酸乙酯组可显著提高细胞的存活率,减轻 H/R所致的细胞损伤,提示这2个萃取部位含有某种化学物质能够减轻 H/R对组织的损伤。有研究[6]报道称氯仿萃取部位和乙酸乙酯萃取部位含有大量的黄酮类物质,黄酮类物质具有降血脂等治疗心脑血管疾病的作用。以上说明香青兰氯仿组和乙酸乙酯组可能是通过黄酮类物质降低H/R对组织的损伤。MTT进入活细胞,被氧化后形成蓝色的结晶物,MTT法的A值即反应心肌细胞的存活情况,又反应心肌细胞内线粒体脱氢酶的活性。该实验中,H/R损伤模型组的心肌细胞的A值明显下降,而预先加入香青兰提取物后,MTT结晶量明显增加,也提示香青兰提取物对心肌细胞具有保护作用。

综上所述:香青兰的不同提取部位可以对抗 H/ R所引起的脂质过氧化损伤,从而保护心肌细胞,尤其以氯仿提取部位和乙酸乙酯提取部位的作用最强。

[1]冯长根,李琼.香青兰化学成分与药理活性研究综述[J].中成药,2003,25(2):155

[2]翟晓秋,刘云刚.大黄提取分离新技术研究进展[J].海峡药学,2007,19(10):4

[3]冯国清,刘洁,付润芳.前列腺素E 1对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].河南医学研究,1997,6(3):216

[4]娄建石,梁会旭,刘艳霞.硝酸甘油与丁丙诺啡合用抗大鼠心肌缺血的药理性预适应研究:早期心脏保护作用[J].中国药理学通报,2003,9(10):1 119

[5]蒋诗琴,龚培力.二氢石蒜碱对大鼠乳鼠培养心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].中国药理学通报, 2005,21(8):999

[6]史春志,谷翔,黎明,等.大蒜素对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤细胞凋亡的影响[J].江苏医药,2006,32 (1):54