顺铂联合葛根素纯品和葛根粗提物对 H446细胞增殖及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

韩 萍,赵妍娟,裴兰英,朱明君,王 旗,时宝庆

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001 2)河南中医学院基础医学院郑州 450008△男,1960年10月生,博士,教授,研究方向:营养与疾病,E-mail:hp999@zzu.edu.cn

肺癌是当前世界最常见的恶性肿瘤之一[1]。化疗是目前治疗中晚期肿瘤的主要手段。顺铂(cisplatin,DDP)是一作用较强的抗肿瘤药物,对肺癌实施的以DDP为主的综合治疗已经取得了显著的疗效。但是DDP的毒副作用较大,还可以因化疗药物耐药而降低疗效[2-3]。所以寻找一些毒性小、不良反应少且有一定疗效的天然药物治疗肿瘤,或者利用它们增加化疗药物的敏感性极其重要。葛根粗提物(pueraria crude extract,CP)是药食两用植物葛根的醇提取物,包含葛根中的多种活性物质。作者观察DDP联合葛根素纯品(standard of pure puerarin,SP)和(或)CP以及DDP单独用药对人小细胞肺癌H446细胞生长及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响,报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 H446细胞(中国科学院上海生命科学院营养所),葛根(河南信阳关门山,经河南中医学院标本馆馆长刘若庸教授鉴定为野葛), DMEM培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(天津TBD血液研究所),噻唑蓝(MTT,美国Sigma公司),二甲基亚砜(DMSO,天津第三化工厂),胰蛋白酶(美国Sigma公司),DDP(云南生物谷灯盏花药业有限公司),葛根素标准品(中国药品生物制品检定所,批号 110752-200209),鼠抗人 Bcl-2单克隆抗体、兔抗人Bax单克隆抗体、SP免疫细胞化学染色试剂盒和DAB显色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司),Leica图像采集系统(上海山富科学仪器有限公司)。

1.2 药物配制 取葛根清洗,切片,在60℃烤箱中烘干 24 h,粉碎,过60目筛后,转入干燥器中保存,采用无水乙醇索氏提取法提取CP。用DMSO溶解CP、SP后加入培养基,配成3.84 g/L的母液,4℃避光保存,使用时用培养基稀释到所需的质量浓度。

1.3 细胞培养 取 H446细胞,用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃、体积分数为5%的 CO2及饱和湿度下常规培养,1～2 d换液 1次。细胞长满瓶底 80%以上时消化传代。

1.4 细胞增殖抑制率的M TT法检测 取对数生长期的 H446细胞,常规消化制成单细胞悬液,计数,调整细胞密度为5×104mL-1,以每孔200μL接种于 96孔培养板中,于 37℃、体积分数为 5%的CO2饱和湿度培养箱中培养,24 h后弃去原培养液,随机分为 16组:空白对照组不接种细胞,只加含不同药物的培养基;实验组接种细胞,分别加入含不同质量浓度的DDP、CP和(或)SP的DMEM培养基, DDP的终质量浓度为1.0、2.0、4.0和 8.0 mg/L, SP、CP的终质量浓度均为80mg/L,每孔200μL,每组设3个复孔。培养24 h后,每孔加入20μLMTT溶液,继续孵育 4 h后快速翻转培养板,弃去上清液,每孔加入150μL DMSO,振荡10 min,用酶联免疫检测仪于492 nm处检测各孔的吸光度(A)。按以下公式计算细胞增殖抑制率:细胞增殖抑制率 = (1-实验组A/对照组A)×100%。

1.5 H 446细胞Bax和Bcl-2蛋白的检测 细胞培养及分组同 1.4。采用SP免疫细胞化学染色试剂盒进行染色,DAB显色。结果判定:Bax和Bcl-2蛋白阳性部位均呈棕黄色,其着色程度用德国Leica图像采集系统进行半定量分析,以平均光密度值对结果进行评价。

1.6 统计学处理 应用SPSS 13.0进行统计分析。采用4×2×2析因设计方差分析法分析DDP、CP和SP的主效应以及DDP与SP、DDP与CP以及DDP与SP和CP的交互效应,检验水准α=0.05。

2 结果

不同质量浓度DDP单独应用及联合80mg/L SP和(或)CP后,H446细胞的增殖抑制率、Bax和Bcl-2蛋白表达的测定结果见表 1～3。析因设计方差分析结果(表4)显示:采用不同质量浓度的DDP, SP和(或)CP对H446细胞的抑制率、Bax和Bcl-2蛋白表达均有影响。DDP联合SP、DDP联合CP、DDP联合SP和CP能增强Bax蛋白的表达和对H446细胞的抑制作用,降低Bcl-2蛋白的表达。

表1 各组H 446细胞增殖抑制率测定结果(n=3) %

表2 各组H 446细胞Bax蛋白表达测定结果(n=3)

表3 各组H 446细胞Bcl-2蛋白表达的测定结果(n=3)

表4 析因设计方差分析结果(n=3)

3 讨论

目前肿瘤化疗存在两大障碍:一是抗肿瘤药物的毒性反应,二是肿瘤细胞的耐药性。有研究[4]发现SP注射液能够逆转SGC7901/VCR对5-氟尿嘧啶(5-FU)的耐药性,SP和5-FU联合应用对裸鼠胃癌的抑瘤率明显高于单纯应用 5-FU组,这为葛根新的临床应用提供了研究基础。另有文献[5]报道 SP能抑制钙通道的开放;在体外实验中SP通过对凋亡基因如fas、bax及bcl-2的调节,诱导肿瘤细胞的凋亡。

抑凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax在细胞凋亡的发生中发挥重要作用,普遍认为Bcl-2与Bax通过形成杂二聚体来控制凋亡发生,Bcl-2/Bax比例上调则抑制细胞凋亡,反之则促进细胞凋亡[6]。析因设计方差分析结果显示,无论是SP、CP单独联合DDP,还是SP、CP同时联合DDP均能增强DDP对H466细胞增殖的抑制作用,并且能增强 DDP增加Bax蛋白的表达,同时增强DDP下调Bcl-2蛋白的表达。

总之,SP、CP与DDP联合应用时,对H 446细胞的增殖抑制率较单独应用DDP有所提高,表明SP、CP可以作为一种化疗增敏剂,既能提升 DDP的抗肿瘤效果,一定程度上克服肿瘤对化疗药物的耐受性,又可减低DDP的使用剂量而减少化疗药的毒副作用,不失为一种值得考虑的化疗方案。

[1]Collins LG,Haines C,Perkel R,et al.Lung cancer:diagnosis andmanagement[J].Am Fam Physician,2007,75 (1):56

[2]崔建东.姜黄素对肺腺癌A549细胞化疗药物的增敏效应及其机制研究[D].成都:第三军医大学,2006.

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[5]温葭,陈士林,徐宏喜.葛根素对细胞凋亡影响的研究[J].现代中药研究与实践,2006,20(1):61

[6]Raisova M,Hossini AM,Eberle J,et al.The Bax/Bcl-2 ratio determines the suscep tibility of humanmelancma cells to CD95/Fas-mediated apoptosis[J].J Investi Dermatol, 2001,117(2):333