丙戊酸钠对Hep-2细胞增殖及COX-2和Survivin mRNA表达的影响

张军辉,赵玉林,张 勇

郑州大学第一附属医院耳鼻喉科郑州 450052

#通讯作者,男,1964年10月生,教授,主任医师,研究方向:头颈部肿瘤的防治

近来临床研究[1]证明,对于局部进展期的肿瘤使用新辅助化疗可缩小肿瘤体积,提高手术根治性切除率,改善治疗效果。近年来发现丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDIs),可以明显抑制多种肿瘤细胞的增殖,诱导其凋亡[2]。喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤,其发病率有逐年增高的趋势,但缺乏针对喉癌的有效化疗药物。作者观察了VPA对喉癌Hep-2细胞增殖及环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和凋亡抑制蛋白Survivin表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人喉癌Hep-2细胞株购自南京凯基生物有限公司。RPMI 1640购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。小牛血清购自杭州四季青公司。VPA、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和Trizol等试剂购自Sigma公司;逆转录试剂盒和dNTPs购自宝生物(大连)有限公司;Taq DNA聚合酶购自Promega公司;DNAMarker购自天根生化科技有限公司;PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 细胞培养和药物处理 Hep-2细胞接种于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中(青霉素和链霉素各100 kU/L),置37℃、体积分数为5% CO2、饱和湿度培养箱中传代培养。将VPA溶于RPMI 1640培养液制成1 000mmol/L的母液,过滤除菌后-20℃备用。

1.3 增殖抑制实验 消化收集对数生长期细胞后计数并调整细胞浓度,按 100μL/孔接种于96孔板。加入含VPA终浓度为1、2、3、4、5mmol/L的RPMI 1640完全培养基。每组设6个复孔。不加VPA仅用培养基为阴性对照。不加细胞只加培养液孔为调零孔。培养12、24、36、48、60及72 h,每孔加入5 g/L MTT溶液20μL,培养箱内继续孵育 4 h,终止培养。小心吸弃培养上清液,每孔加入DMSO 150μL,振荡10min,于酶联免疫检测仪上测570 nm波长处的吸光度(A),计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(阴性对照组A-给药组A)/阴性对照组A×100%。实验重复3次。

1.4 Hep-2细胞COX-2和Survivin mRNA检测采用Trizol抽提法提取3 mmol/L VPA分别作用0、24、48及72 h后的Hep-2细胞的总RNA,电泳检测纯度,取适量RNA为模板逆转录得cDNA。取适量cDNA作模板,以β-actin为内参照,进行PCR。PCR扩增引物序列如下:COX-2上游5'-GTCTGATGATG TATGCCACAATCTG-3',下游5'-GATGCCAGTGAT AGAGGGTGTTAAA-3',退火温度60℃,扩增片段大小276 bp。Survivin上游5'-CAGATTTGAATCGCGG GACCC-3',下游5'-CCAAGTCTGGCTCGTTCTCAG-3',退火温度61℃,扩增片段大小208 bp。β-actin引物上游5'-GCAGCCGTGGCCATCTCTTGCTC-3';下游5'-AACCGCGAGAAGATGACCCAGATC-3',扩增片段大小350 bp。反应条件为94℃4min;94℃30 s,退火30 s,72℃60 s,28个循环;最后72℃10 min。反应完成后取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪扫描成像。以目的基因与β-actin mRNA条带光密度的比值表示mRNA的相对表达量。

1.5 统计学处理 应用SAS 6.12和SPSS 13.0进行统计学处理。不同组别不同时间点细胞生长抑制率、COX-2及Survivin mRNA相对表达量的比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 VPA对Hep-2细胞增殖的影响 增殖抑制实验结果见表1。可知,VPA对Hep-2细胞有明显的生长抑制作用,并呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性。

表1 5组细胞增殖抑制率测定结果(n=3) %

2.2 VPA对Hep-2细胞COX-2和Survivin m RNA表达的影响 RT-PCR结果见图1。

图1 3mmo l/L VPA作用不同时间后Hep-2细胞COX-2(上)及Survivin(下)mRNA的表达M:Marker;1:0h;2:24 h;3:48h;4:72 h。

Hep-2细胞COX-2和Survivin mRNA测定结果见表2。可知,3 mmol/L VPA作用后Hep-2细胞中COX-2和Survivin mRNA的表达下调。

表2 VPA对Hep-2细胞中COX-2和Survivin mRNA影响的表达(n=3)

3 讨论

近年研究[3]表明,临床上作为一线抗癫痫病药物的VPA在抗癫痫病有效治疗浓度时表现出很强的HDIs活性,从而抑制肿瘤细胞的增殖,VPA还参与调节肿瘤细胞增殖、诱导分化及凋亡等有关基因的表达而达到治疗肿瘤的目的。作者也发现,VPA可抑制Hep-2细胞的增殖,该作用表现出剂量和时间依赖性。

诱导型环氧化酶即COX-2是花生四烯酸转变成前列腺素的主要限速酶之一,近年研究[4-5]表明,其在多种肿瘤组织中过度表达,通过促进增殖、抑制凋亡、提高肿瘤发生及转移的潜能、抑制免疫、诱导前致癌物活化、促使癌基因及抑癌基因活性改变等多种致癌机制参与肿瘤增殖转移过程。体内外实验[6-7]也证实COX-2抑制剂可预防某些肿瘤的发生,抑制肿瘤生长、增殖及转移。因此,COX-2成为当前肿瘤防治的靶点。作者观察到,VPA可下调喉癌Hep-2细胞COX-2mRNA的表达,且呈时间依赖性。

Survivin是迄今为止发现的抑制凋亡作用最强的因子,是近几年来国内外肿瘤研究中的一个热点[8-9]。survivin还有可能作为一种抗凋亡保护性基因参与血管生成[10]。作者观察到,VPA作用于喉癌Hep-2细胞后,细胞中survivinmRNA的表达下调,且呈时间依赖性。

总之,该研究结果表明,VPA可以抑制喉癌Hep-2细胞的增殖,该作用可能与下调COX和Survivin的表达有关。VPA抗肿瘤的内在机制很复杂,而COX-2和Survivin可能只是其中的一个方面,关于VPA如何引起COX-2和Survivin基因的变化, VPA是否通过其他途径引起肿瘤细胞生长抑制,从而起到抗肿瘤的作用,均需要进一步探讨。

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