河南汉族缺血性脑血管病患者胱硫醚 β-合成酶基因 T27796C多态性检测*

路 燕,滕军放

郑州大学第一附属医院神经内科郑州 450052

#通讯作者,男,1960年11月生,本科,主任医师,教授,研究方向:脑血管病防治及睡眠障碍治疗,E-mail:tjf.6666@yahoo.com.cn

近年来缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular diseases,ICVD)的病因及发病机制研究已取得很大的进展,高同型半胱氨酸血症(HHcy)也被认为是ICVD的独立危险因素之一,而引起同型半胱氨酸(Hcy)升高的主要因素是其相关代谢酶的辅酶维生素缺乏。已发现亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR) C677T基因突变可引起血浆 Hcy水平升高,导致脑血管疾病的发生[1]。胱硫醚-β合成酶 (CBS) 844ins68基因多态性可造成CBS缺陷,引起重度HHcy及过早动脉粥样硬化,从而导致血管内多发血栓形成[2]。CBST833C基因突变与缺血性脑卒中存在关联,可能是缺血性脑卒中的遗传危险因素[3]。作者采用病例-对照研究探讨 CBS T27796C基因位点多态性与ICVD的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 92例ICVD患者(病例组)和52例对照(对照组)来自 2008年 12月至2009年 4月郑州大学第一附属医院神经内科住院患者及门诊体检者,均为河南汉族人。病例组符合 1995年第 4届全国脑血管病学术会议修订的急性 ICVD的诊断标准,并经头颅CT和(或)MRI检查确诊;对照组为无ICVD病史、无临床血管事件发生的神经内科其他住院患者及健康体检者。2组均排除脑出血、蛛网膜下腔出血等出血性脑血管疾病,均无帕金森病、痴呆、甲状腺、肝脏及肾脏疾病及服用叶酸、维生素 B12及美多芭等药物史。病例组 92例,男 68例,女 24例,年龄 39～86岁。对照组52例,男35例,女 17例,年龄 39～87岁。2组性别及年龄分布差异均无统计学意义(χ2=0.712,P=0.399;t=1.548,P=0.124)。1.2 CBST 27796C基因多态性检测 采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。取EDTA抗凝静脉血2 m L,采用CBM公司基因提取试剂盒提取人全血基因组DNA。参照文献[4]设计引物,上游引物5'-ACAATCAGCGGCATTTAGTA-3',下游引物5'-ACAGAGACACAAAGTCGATC-3',扩增产物大小为176 bp。PCR反应体系为30μL: PCRMagic Mix 2.0酶(CBM公司)15μL,上、下游

引物(10μmol/L)各2.0μL,模板DNA 2.0μL, ddH2O补至30μL。PCR扩增条件:94℃预变性5 min;94℃变性40 s,55℃复性40 s,72℃延伸90 s,循环34次;72℃延伸10 min。PCR产物经25 g/L琼脂糖凝胶电泳,EB染色检验扩增结果。酶切反应体系为30μL:PCR扩增产物10μL,HpaⅡ2.0μL, 10×Buffer Tango 2.0μL,ddH2O 16μL。酶切产物在37℃水浴箱中温浴3 h,经30 g/L琼脂糖凝胶电泳分析,EB染色,紫外凝胶成像仪下观察带型并照相。

1.3 统计学处理 数据采用SPSS 16.0处理。对2组基因型和等位基因频率分布差异行 χ2检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 2组CBS T27796C基因型频率的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(病例组 χ2=2.938,对照组 χ2=2.848, P均 ＞0.05)。2组样本有群体代表性。

2.2 2组CBS T27796C基因型及等位基因频率分布 见表1。T/T野生型与C/C纯合子基因频率及C等位基因分布频率差异有统计学意义,T/T野生型与C/T纯合子基因型频率差异无统计学意义。

表1 2组CBS T27796C基因型及等位基因频率分布 例(%)

2.3 PCR-RFLP检测结果 PCR扩增产物经HpaⅡ酶切后,共有3种基因型:野生型(T/T型)只有176 bp;杂合子突变型(C/T型)有176、100和76 bp 3个片段;纯合子突变型(C/C型)有100和76 bp 2个片段。CBS基因T27796C酶切产物见图1。

图1 PCR-RFLP产物电泳图M:DNA Marker;1,2,4,6,10:C/C型;3,5,8:T/T型;7,9:C/T型。

3 讨论

人类CBS基因位于 21q22-3染色体上,全长28 046 bp,可编码 551个氨基酸。Kraus等[5]通过基因组序列分析发现人类CBS基因含有23个外显子,片段长度从42 bp到299 bp不等。目前已发现CBS基因上至少存在着 80个位点突变,多为单位点突变,且均为单一型,多分布于第 3和第 8外显子上。CBS基因所编码的蛋白CBS是人体内Hcy代谢的关键酶,人体内约一半Hcy通过CBS和胱硫醚裂解酶不可逆地生成半胱氨酸;另一半则通过再甲基化形成蛋氨酸。此外,Hcy与半胱氨酸形成二硫化合物,使Hcy释放于细胞外亦主要受CBS的影响[6]。

该研究结果显示,病例组和对照组 CBS T27796C C等位基因频率与 C/C基因型频率差异均有统计学意义,提示CBST27796C基因纯合子突变型可能与河南汉族人ICVD的发生有关,可能是ICVD的遗传影响因素之一。这与国内报道[6]结果不一致,分析原因可能如下:①入选病例的排除标准不同、各种缺血性脑卒中所占比例不同及所选样本量不同均可能造成研究结果不一致。②即使是同一种族在不同地区的基因突变率也可能不同,造成其遗传易感性不同。③该研究所涉及的样本量仍然相对较少,病例-对照研究所产生的偏倚也可能对研究结果产生影响。

该研究结果对于进一步了解ICVD的发病机制及遗传影响因素有一定的参考意义,但因CBS基因上有数十个突变位点,因此不能否认CBS为ICVD的易感基因,有待于进一步在不同地区进行大样本、多中心研究。

[1]Zhang G,Dai C.Correlation analysis between plasma homocysteine level and polymorphism of homocysteinemetabolism related enzymes in ischemic cerebrovascu lar or cardiovascu lar diseases[J].Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi, 2002,23(3):126

[2]Robert K,Chasse JF,Santiard-Bazon D,et al.Altered gene exp ression in liver from a murine model of hyperhomocysteinemia[J].JBiol Chem,2003,278(34):31 504

[3]Wu JM,Wang TG,LiYQ,et al.Genetic mutations ofhomocysteinemetabolism related enzymes in patients with ischem ic stroke[J].YiChuan,2004,26(3):298

[4]傅毅,刘建荣,倪培华,等.同型半胱氨酸及代谢酶基因多态性与脑卒中的相关性研究[J].中华老年医学杂志,2005,24(6):413

[5]Kraus JP,Oliveriusova J,Sokolova J,et al.The human cystathionineβ-synthase(CBS)gene:complete sequence, alternative splicing,and polymorphisms[J].Genomics, 1998,52(3):312

[6]方乐,邬巍,邬英全,胱硫醚 β-合成酶基因多态性与脑卒中相关性的研究[J].中国危重病急救医学,2004,16 (3):161