人脂肪间充质干细胞体外分化为视网膜细胞观察*

晁炜静,李康华,戴荣平,韩 钦,闫 曦,赵 潺,于伟泓,董方田,赵春华#

1)中国医学科学院北京协和医院眼科北京 100730 2)武警河南总队医院眼科 郑州 450052 3)中国医学科学院北京协和医科大学基础医学研究所组织工程中心 100730

#通讯作者,男,1963年6月生,博士,教授,研究方向:干细胞生物学基础与临床应用,E-mail:chunhuaz@pub lic.tpt.tj.cn

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是成体干细胞的一种,存在于多种组织中,在体外具有很强的克隆形成和扩增能力,并具有向 3种胚层细胞分化的潜能。研究[1-3]发现,骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cell,BM-MSC)在体外经诱导可以分化为视网膜细胞,但是获取 BMMSC有一定的创伤,且获取数量有限。成人脂肪间充质干细胞(human adipose derived-mesenchymal stem cell,hAD-MSC)与BM-MSC在干细胞的产率、生长动力学、多谱系分化潜能、基因转导效率和表型等方面都相似,而且脂肪组织较骨髓来源丰富,容易取材,组织损伤小,所以hAD-MSC在临床上的应用越来越受到人们的重视[4-6]。临床上,很多眼科疾病受损伤的靶细胞为脉络膜毛细血管内皮细胞、视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)和光感受器细胞,延缓这些细胞的损伤、恢复其功能或者重建视网膜结构成为目前研究的重点。在该实验中,作者首先从成人脂肪组织中分离得到hAD-MSC,经体外诱导后,证明其可以分化为血管内皮细胞;然后进一步制作视网膜细胞诱导液,体外诱导hAD-MSC分化为RPE、光感受器细胞,为进一步hAD-MSC体内移植治疗眼科相关疾病的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 hAD-M SC的分离、培养和鉴定

1.1.1 hAD-MSC的分离、培养 取健康成人脂肪组织,用D-Hank's液反复冲洗,1.0 g/L的Ⅰ型胶原酶 37℃消化 1 h,过 100目筛网,将滤出液常温离心10min(1 200 r/min),弃去上清液,再用D-Hank's液重悬洗涤2遍(1 200 r/m in室温离心10 min)以除去Ⅰ型胶原酶,最后离心,弃去上清液,收集细胞,用移液管吹打使之成为单细胞悬液,以2×106mL-1的密度接种于含体积分数分别为58%DMEM/F12、40%MCDB-201、2%胎牛血清(FCS)和10μg/L表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)及1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(ITS)及1×亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)的培养液中,37℃、体积分数为5% CO2培养箱培养,2 d后换液,弃去未贴壁的细胞。以后每3 d半量换液。当细胞密度达70%～80%时,用1.25 g/L胰蛋白酶常规消化,细胞按照1:3进行传代,实验中使用的为第 2代或第 3代细胞。

1.1.2 hAD-MSC的免疫表型分析 用1.25 g/L胰酶常规消化hAD-MSC细胞,按每管2×105个细胞,用40.0 g/L多聚甲醛4℃固定10 min后,用含有1.0 g/L叠氮钠和体积分数为 0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗2遍,1 000 r/min室温离心6 min,加入FITC或PE标记的小鼠抗人直标一抗,4℃孵育45min,FITC或PE标记的同种异型IgG1作为阴性对照。之后用PBS洗2遍,1000 r/min室温离心6min,用0.5mL不含BSA的PBS重悬细胞,流式细胞仪检测CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105、Flk-1和MHCⅡ类分子的表达。检测Flk-1时,在加入一抗前,用40.0 g/L多聚甲醛4℃固定10min,体积分数为0.1%皂素破膜1 h,其余步骤同上。

1.1.3 hAD-MSC的细胞周期测定 将1×106个细胞用体积分数为 80%的冷乙醇 4℃固定 1 h。PBS洗2遍,0.5 mL PBS重悬细胞,加100 mg/L的RNaseA,于37℃孵育30m in。测定前10 min加5 mg/L的碘化丙啶(PI)染色,上流式细胞仪(BD FAC Scan),汞灯488 nm波长激发光激发。以ModiFit软件分析细胞周期。

1.2 hAD-MSC成血管内皮细胞诱导 用Matrigel包被24孔培养板,按 5×104个细胞/孔接种hADMSC。内皮细胞诱导液为 M 199、体积分数为 2% FBS、50μg/L血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)、10μg/L成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和100mg/L青霉素及0.1U/L硫酸链霉素。诱导2～3 d。光学显微镜下记录hAD-MSC的细胞形态变化过程,并以免疫荧光方法鉴定分化结果,抗体分别为兔抗人血管内皮细胞Ⅷ因子(vWF)一抗(Santa Cruz公司,工作浓度为1:100),Tritc标记的山羊抗兔IgG抗体(Santa Cruz公司,工作浓度为1:100)。

1.3 hAD-MSC成视网膜细胞诱导

1.3.1 诱导液制备 选取成年Lewis大鼠,颈椎脱臼处死,消毒,超净工作台上取出大鼠眼球,去除前节和玻璃体,小心用虹膜恢复器分离出完整的视网膜,将视网膜组织移入离心管中,加入1.0 g/L胰蛋白酶溶液后放入孵育箱中消化30 min,用含体积分数为10%FCS的DMEM终止消化,过滤,离心,收集视网膜细胞。将大鼠眼球剩下的眼杯放射状剪开,铺平后加入2.5 g/L胰蛋白酶,放入孵育箱中消化45min,用巴斯德吸管吸取培养液,轻轻吹打眼杯内壁,以使RPE脱落,收集细胞悬液,离心,弃上清液,收集细胞。将 2种细胞共同接种于培养瓶中放入孵育箱培养。每天在显微镜下观察,细胞生长良好后按5×105mL-1重悬于细胞培养液中,然后对培养瓶中的细胞照射10min,照射剂量1.0Gy/min。照射后将细胞悬液静置 12 h,离心收集上清液,再加入等体积的细胞培养液,以此作为hAD-MSC的诱导母液备用。

1.3.2 成RPE和光细胞感受器诱导 hAD-MSC接种于 6孔板,以扩增培养液培养,细胞贴壁 12 h后,换为上述配置的诱导母液培养,同时加入 EGF (0.1 mg/L)、牛磺酸(50μmol/L)和视黄酸(0.5 μmol/L),每3 d半量换液,诱导培养10 d,免疫荧光方法鉴定分化结果,抗体分别为小鼠抗人视紫红质(Rhodopsin)单克隆抗体(Neomarker公司,工作浓度为1:50)、小鼠抗人细胞角蛋白(Pan-CK)单克隆抗体(Sigma公司,工作浓度为1:100)一抗和FITC标记或TRITC标记的羊抗小鼠抗体(Santa Cruz公司)。

2 结果

2.1 体外培养hAD-MSC的生物学性状 从成人脂肪组织中分离得到的hAD-MSC在原代培养中,有2类细胞生长,一种细胞呈梭形,分散生长;另一种细胞呈多角形,紧密生长。经过传代,多角形细胞逐渐减少,传至第 3代时,基本消失,视野中均为梭形细胞。免疫表型分析结果显示:hAD-MSC高表达CD29、CD44、CD105和Flk-1,低表达MHCⅡ类分子,不表达造血及内皮细胞标志(CD31、CD34和CD45)。细胞周期分析发现多数hAD-MSC位于G0/G1期。

2.2 hAD-MSC成血管内皮细胞诱导结果 诱导最初的12 h内,接种的hAD-MSC由圆形逐渐伸展成短梭形,由分散状态逐渐变成一些聚集的细胞群;24 h后,细胞簇变大,簇与簇之间连接,初步形成网格状;48 h后,网格之间连线变细,由节点互相连接,形成网格样结构(图1A)。免疫荧光染色显示,多数细胞表达血管内皮细胞表面标志vWF(图1B)。

2.3 hAD-M SC成RPE和光感受器细胞诱导结果

hAD-MSC在诱导因子和诱导液的共同作用下,细胞形态由圆形变得不规则,呈多角形,突起增多,免疫荧光染色显示多数细胞表达 RPE细胞的表面标志Pan-CK(图1C);亦有多数细胞表达光感受器细胞的表面标志Rhodopsin(图1D)。

图1 hAD-M SC体外诱导分化结果(×200)A:hAD-MSC成内皮细胞诱导48 h后的形态;B:hAD-MSC成内皮细胞诱导48 h vWF免疫荧光染色;C:hAD-MSC成RPE诱导后Pan-CK免疫荧光染色;D:hAD-MSC成光感受器细胞诱导后Rhodopsin免疫荧光染色。

3 讨论

视网膜变性疾病包括视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性等,是眼科主要的致盲性疾病,目前尚缺乏有效的治疗手段。随着人们对干细胞的深入研究,干细胞移植为视网膜变性疾病的治疗带来新的希望,其中种子细胞的选择是关键环节[2-3]。干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。胚胎干细胞的分化潜能大,可以向内、中和外 3个胚层的细胞和组织分化,但是伦理学问题限制了其广泛应用。成体干细胞也具有多向分化潜能,而且取材容易,不存在伦理学问题,成为近年来研究的热点。成体干细胞中,AD-MSC可以体外分化为脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞、骨细胞、软骨细胞[7]、血管内皮细胞[8]、平滑肌细胞[9]和骨骼肌细胞[10]等,但是还没有关于AD-MSC向视网膜细胞方面分化的报道。

作者对hAD-MSC体外诱导为视网膜细胞进行了研究,借鉴了Kicic等[2]诱导BM-MSC分化为视网膜光感受器细胞的方法,选用了 EGF、视黄酸和牛黄酸,这些因子不管是在胚胎眼还是出生后眼光感受器细胞的发育过程中均起重要的促进作用。同时,为了更好的诱导hAD-MSC的分化,作者还对诱导方法加以改进,制备了体外诱导液。Xiao等[11]研究证实,当分离培养得到的视网膜细胞受到照射损伤时会应激产生一些生长因子,如:胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ,IGF-Ⅰ)、bFGF、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)和VEGF等,这些生长因子在组织损伤愈合过程中起重要作用,可以促进受伤部位的细胞有丝分裂、合成细胞外基质等。所以作者把培养的视网膜细胞进行照射,使细胞应激分泌生长因子到培养液里,收集这些培养液制备成hAD-MSC的诱导母液,诱导母液中的生长因子就会发挥作用,联合诱导剂的应用,可以创造一个更好的细胞诱导微环境。

该实验证实,hAD-MSC可以体外诱导分化为血管内皮细胞,并且在诱导剂和诱导液的共同作用下, hAD-MSC还可以体外诱导分化为视网膜RPE和光感受器细胞,这为进一步的hAD-MSC体内分化研究和对视网膜疾病的治疗奠定了基础。

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