Hep-2细胞中bFGF及其双受体系统mRNA的表达*

陈广理1,2)△,龚树生3),陈 沛1),罗凌惠1)

1)华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科武汉 430022 2)洛阳东方医院耳鼻咽喉科洛阳 471003 3)首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科北京 100730

△男,1971年4月生,博士,副主任医师,研究方向:耳鼻咽喉疾病的基础与临床,E-mail:glchen71@yahoo.com.cn

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是内皮细胞促进作用最强、特异性最高的因子之一[1],bFGF主要是通过其高亲和力酪氨酸激酶受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)和细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)组成的双受体系统发挥生物活性[2],共同促进细胞的增殖、分化,诱导新生血管的形成[3-4],与肺癌、食管癌、肝癌及黑色素瘤等多种肿瘤的发生发展有关[5-7]。串珠素(perlecan)是一种重要的HSPG,bFGF与perlecan的结合是bFGF与其高亲和力受体相结合的必要条件[8]。喉癌是具有一定浸润和转移能力的肿瘤。作者分析了bFGF、FGFR1～4及perlecan mRNA在喉癌细胞Hep-2中的表达,探讨其与喉癌细胞生长、浸润及转移的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和设备 RPMI 1640培养基(美国Hyclon公司),胎牛血清(美国Sigma公司),Trizol试剂(美国Gibco公司),逆转录酶MLV、Taq DNA聚合酶及dNTP(美国MBI公司),PTC200 PCR仪(美国MJA公司),DU650型紫外分光光度仪(美国Beckman公司),GDS8000型凝胶成像系统(英国UVP公司)。

1.2 细胞培养 人喉癌细胞系Hep-2和正常永生化表皮细胞系HaCaT购于中国典型培养物保藏中心。Hep-2和HaCaT细胞用含体积分数10%的胎牛血清和300 mg/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养基培养,培养条件为37℃、体积分数5%CO2。每2～3 d用2.5 g/L胰蛋白酶消化并传代一次。

1.3 2种细胞内bFGF、FGFR及perlecan m RNA的检测 将90%底壁长满细胞(约6×106个细胞)的100mL培养瓶置于冰上,吸去培养液,直接加入1m L Trizol试剂,反复吹打,然后按说明用氯仿和异丙醇逐步提取RNA。以RNA为模板逆转录合成cDNA。以cDNA为模板,以β-actin为内参照物,进行PCR,引物设计见表1[9],引物由上海博亚生物技术有限公司合成。反应体系(25μL)中含cDNA 2.0μL,10×PCR缓冲液2.5μL,Mg2+终浓度为2.0mmol/L,dNTP终浓度为0.2 mmol/L,上、下游引物终浓度为0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶1 U。反应条件:95℃预变性5min;95℃1 min,55℃1 min,72℃1 min,共34个循环;然后72℃延伸5 min。应用降落PCR方法进行FGFR3与β-actin的PCR。反应结束后取5μL产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察并用Grab-It成像系统照相,然后用Gelworks 1D Interdiate软件分析各条带的吸光度值,以目的基因与β-actin条带吸光度值的比值表示目的基因的相对表达量。

1.4 统计学处理 用SPSS 12.0进行分析,2种细胞中bFGF、FGFR1～4及perlecan mRNA相对表达量的比较用两独立样本的t检验,检验水准α=0.05。

表1 引物序列

2 结果

2种细胞中均未检测到FGFR3 mRNA。Hep-2及HaCaT细胞中bFGF、perlecan、FGFR1、FGFR2及FGFR 4 mRNA的检测结果见图1～4及表2。

表2 Hep-2及HaCaT细胞中bFGF、FGFR及perlecan mRNA的相对表达量

3 讨论

bFGF主要是通过高亲和力受体FGFR和辅助受体perlecan系统发挥重要生物活性,在大多数肿瘤组织中高表达,且 3者同时高表达预示肿瘤分化程度更低,更容易浸润和转移[9]。bFGF和perlecan结合可抵抗蛋白酶的降解,延长bFGF的作用时间,并增强其稳定性。bFGF与perlecan的结合也是bFGF与FGFR相结合的必要条件[8],游离的bFGF不能直接与FGFR作用。bFGF和perlecan结合是调节bFGF活性的一种手段。因此,bFGF及其双受体系统与肿瘤的发生发展关系密切,成为判断肿瘤恶性程度、预测转移和预后的指标。

作者的研究结果表明,bFGF、FGFR1、FGFD2、FGFD4及perlecan mRNA在喉癌细胞Hep-2中高表达,在正常HaCaT细胞中低表达,并且表达较恒定, 2种细胞中均未检测到FGFR3mRNA。说明Hep-2细胞不但分泌bFGF,而且可分泌bFGF的双受体, Hep-2细胞中bFGF与perlecan及FGFR双受体紧密结合,通过信号转导,促进Hep-2细胞快速生长和失控增殖。喉癌细胞Hep-2的发生发展与bFGF、perlecan和FGFR的关系密切,喉癌细胞具有失控增殖、侵袭及转移特征。因此,bFGF及其双受体在喉癌细胞中的表达可为诊断提供依据。同时它们也是治疗的重要靶分子,抑制或阻断bFGF及双受体系统在喉癌细胞中的表达可能对抑制肿瘤生长、浸润及转移有重要价值。

[1]Sukhthankar M,Yamaguchi K,Lee SH,et al.A green tea component suppresses posttranslational expression of basic fibroblast grow th factor in colorectal cancer[J].Gastroenterology,2008,134(7):1 972

[2]Chu CL,Buczek-Thomas JA,Nugent MA.Heparan sulphate proteoglycans modulate fibroblast growth factor-2 binding through a lipid raft-mediated mechanism[J].Biochem J, 2004,379(Pt 2):331

[3]Yan W,Bentley B,Shao R.Distinct angiogenic mediators are required for basic fibrob last growth factor-and vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis:the role of cytop lasm ic tyrosine kinase c-Ab l in tumor angiogenesis [J].Mol Biol Cell,2008,19(5):2 278

[4]Jiang X,Couchman JR.Perlecan and tumor angiogenesis [J].JHistochem Cytochem,2003,51(1):1 393

[5]Ida-Yonemochi H,Ikarashi T,Nagata M,et al.The basementmembrane-type heparan sulfate proteoglycan(perlecan)in amelob lastomas:its intercellular localization in stellate reticulum-like foci and biosynthesis by tumor cells in cu lture[J].Virchows Arch,2002,441(2):165

[6]Datta MW,Hernandez AM,Sch licht MJ,et al.Perlecan,a candidate gene for the CAPB locus,regulates prostate cancer cell grow th via the Sonic Hedgehog pathway[J].Mol Cancer,2006,5:9

[7]Ghiselli G,Eichstetter I,Iozzo RV.A role for the perlecan p rotein core in theactivation of the keratinocyte growth factor receptor[J].Biochem J,2001,359(Pt 1):153

[8]Aviezer D,Levy E,Safran M,et al.Differential structural requirements of heparin and heparan sulfate proteoglycans that promote binding of basic fibroblast growth factor to its receptor[J].JBiol Chem,1994,269(1):114

[9]Bieker R,Padro T,Kramer J,et al.Overexpression of basic fibroblast growth factor and autocrine stimulation in acute myeloid leukemia[J].Cancer Res,2003,63(21):7 241