非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏、骨骼肌、脂肪组织脂联素受体的表达

刘 斌，刘 苏，朱风尚，陈锡美，吴建平，蒋 芳

（1.上海市闸北区中心医院消化科，上海 200070； 2.上海同济大学附属同济医院消化科，上海 200065）

非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）的发病率日渐攀高，而病因及发病机制尚未阐明，大量研究证实NASH患者血清脂联素（adiponectin，Adipo）表达降低，脂联素与NASH密切相关[1]，而脂联素受体(adiponectin receptor，AdipoR)在NASH发病中的表达变化及其意义目前并不清楚。本研究拟以高脂饮食诱导NASH大鼠，观察肝脏、骨骼肌及脂肪组织的AdipoR1、AdipoR2表达在NASH发病中的变化，初步探讨AdipoR1、AdipoR2在NASH发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级SD雄性大鼠20只，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，鼠龄4～5周，体质量150～180 g，饲养于上海同济医院试验动物中心，室温控制在22℃～26℃。动物基础饲料购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，胆固醇纯品购自上海如吉生物科教有限公司，猪油市购，Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自立陶宛MBI公司。

1.2 方法

1.2.1 NASH动物模型构建[2]与分组：20只大鼠基础饲料喂养1周后随机分为2组，正常组（n=10）喂养基础饲料，模型组（n=10）喂养自配高脂饲料（88%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇），在第20周末大鼠隔夜禁食10 h，2%戊巴比妥钠45 mg/kg体质量腹腔注射麻醉，称体质量，股动脉放血处死，取血清、肝脏、骨骼肌及内脏白色脂肪组织保存备用。

1.2.2 血生化指标检测：ADVIA1650全自动生化分析仪（Bayer公司）检测血清空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）等指标。

1.2.3 荧光定量PCR检测AdipoR1、AdipoR2mRNA：⑴引物设计：参考文献[3]和Primer Premier5.0软件设计，由上海申能博彩生物科技有限公司合成。序列为：AdipoR1上游引物为5'-GCTGGCCTTTATGCTGCTCG-3'，下游引物为5 '-TCTAG GCCGTAACGGAATTC-3'， 扩增片段158bp；AdipoR2上游引物为5'-CCACAACCTTGCTTCATCTA-3'，下游引物为5'-GATACTGAGGGGTGGCAAAC-3'，扩增片段100bp；GAPDH上游引物为5'- AGATCCACAACGGATACATT -3'，下游引物为5 '- TCCCTCAAGATTGTCAGCAA -3'，扩增片段508bp；⑵总RNA提取：收集的组织加入1 mL Trizol预冷；电动匀浆器8000 rpm/min转速处理30～45 s，每标本间处理后用75%乙醇的配置：1倍的DEPC处理水加3倍的无水乙醇棉球擦拭， DEPC处理水清洗；肝匀浆液加入200 μL氯仿，振荡摇匀15 s；4℃，12000 rpm/min，离心15 min；转出上层水相，加入二倍体积的异丙醇(约600 μL)，混匀，置于-20℃冰箱，30 min；4℃，10000 rpm/min，离心15 min弃上清留沉淀；用650 μL75%乙醇洗涤沉淀，4℃，8000 rpm/min，离心5 min，弃上清留沉淀；再重复1遍；干式恒温器65℃，5～10 min，烘干；20 μLDEPC处理水，溶解RNA，-80℃冰箱，保存待用；⑶RTPCR：将稀释后的RNA样本根据试剂盒说明书进行RT，反应体系如下：5×逆转录buffer 4 μL ，oligo（d T）0.5 μL，dNTPs0.5 μL，逆转录酶MMLV1 μL，DEPC处理水10μL，RNA模板4 μL。反应条件：37℃；1 h；95℃，5 min，灭活MMLV，产物cDNA -20℃保存待用；⑷RT－PCR反应：将制备好的cDNA进行PCR扩增，扩增体系如下：SYBRGreen Mix12.5 μL，上游引物F0.5 μl，下游引物R0.5 μL，ddH2O水10.5 μL，cDNA模板1.0 μL。反应条件：95℃ 3 min，40循环（95℃20 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s检测荧光）60℃1 min，缓慢升温至95℃，每秒钟升高5℃，连续检测荧光度，绘制熔解曲线；⑸标准曲线制作和数据分析：选取正常组样本作标准曲线，样本作2倍稀释，选取5个梯度（1倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍），同时做2个重复浓度检验操作准确性，使标准曲线可信度达到0.99左右。由PCR反应曲线得到Ct（cycle threshold）值，采用GAPDH为内参，计算基因相对表达量：ΔCt=目标基因Ct值－内参Ct值，mRNA相对表达量=2-Δct× 100%，数据采用仪器自带ABI Prism 7500 SDS Software分析。

1.3 肝脏组织病理学检测

肝组织石蜡切片做苏木素-伊红（HE）染色和Masson三合染色后光镜下观察，病理学评分标准参照中华医学会NAFLD诊疗指南[4]。

1.4 统计学分析

采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，计量资料采用“±s”表示，多组间比较采用单因素方差分析检验，等级资料比较采用秩和检验，以P＜0.05为差异统计学意义。

2 结果

2.1 一般指标比较

和正常组相比，模型组大鼠的体质量、血糖、TCH、 TG、ALT、AST均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1。

2.2 肝组织病理学改变

表1 2组大鼠一般指标比较

表1 2组大鼠一般指标比较

注：与正常组比，#P＜0.05。

组 别 体质量（g） FPG(mmoL/L) Tch(mmoL/L) TG(mmoL/L) ALT(U/L) AST(U/L)正常组 471.67±70.06 6.69±0.31 1.53±0.34 0.59±0.19 53.50±3.89 45.90±7.96模型组 540.00±52.20# 11.43±0.18# 3.57±0.21# 1.04±0.18# 108.33±10.11# 164.33±33.54#

光镜下正常组肝脏肝小叶结构正常，部分偶见脂肪滴，小叶内几乎不见炎症细胞，无纤维化。模型组见肝细胞索排列紊乱，肝细胞肿胀、气球样变性，小叶内可见炎症细胞及散在点灶坏死，汇管区见局灶性星芒状纤维化，见图1。等级资料经秩和统计分析，脂肪变、炎症和纤维化均差异明显（Z=-2.304，P=0.021；Z=-2.541，P=0.011；Z=-2.408，P=0.016）。见表2。

2.3 AdipoR1、AdipoR2mRNA表达

表2 2组大鼠肝脏病理学积分比较

2.3.1 标准曲线：以起始拷贝数自然对数为横坐标，以循环阈值为纵坐标，每次试验得到一条严格的直线型标准曲线，线性相关系数＞0.98，证明用Ct值定量的准确性见图1。

2.3.2 扩增动力学曲线见图2。扩增产物的熔解曲线显示均为单峰见图3，证实产物特异性。

2.3.4 基因表达变化：和正常组相比，模型组大鼠肝脏及脂肪组织AdipoR1、AdipoR2mRNA表达下降（P＜0.05），骨骼肌AdipoR1、AdipoR2mRNA表达上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果见表3。

图1 实时定量PCR参照标准曲线图

图2 标准参照的实时PCR扩增动力学曲线图

图3 adipoR-1基因熔解曲线分析图

表3 2组大鼠肝脏、骨骼肌、脂肪AdipoR1、AdipoR2 mRNA表达的比较

表3 2组大鼠肝脏、骨骼肌、脂肪AdipoR1、AdipoR2 mRNA表达的比较

注：与正常组比，#P＜0.05。

AdipoR1 AdipoR2肝脏 骨骼肌 脂肪 肝脏 骨骼肌 脂肪正常组 2.13±0.13 2.47±0.66 1.39±0.14 1.75±0.19 0.46±0.15 1.58±0.18模型组 0.98±0.04# 6.98±0.56# 0.19±0.11# 0.34±0.10# 4.52±0.97# 0.47±0.07#组别

3 讨论

NASH的发病机制目前认为与胰岛素抵抗、脂质过氧化及炎症因子等二次或多次打击有关，而脂联素因与胰岛素抵抗、细胞炎症因子均密切相关而成为NASH发病机制研究中的热点。脂联素受体是细胞膜上的一组蛋白分子，它能特异性识别脂联素，与之结合后通过激活过氧化物酶体增生物激活受体α(PPARα)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、p38有丝分裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等信号途径，促进脂肪酸氧化和葡萄糖摄取，产生抗炎，增敏胰岛素、抗动脉粥样硬化等作用[5]，脂联素生物学效应通过AdipoR介导完成，AdipoR应也与NASH发病相关。Kaser S[6]等报道：与单纯脂肪变性患者比较，NASH患者肝脏中AdipoR2 mRNA显著减少，AdipoR1的表达无差别。钱晓武[7]等报道在NASH发生发展过程中，肝脏脂联素及其受体AdipoR2表达下降。事实上AdipoR1、AdipoR2在骨骼肌、肝脏、脂肪组织均有大量表达，作为脂联素产生的主要部位－内脏白色脂肪组织，糖、脂肪能量代谢的主要效应器官之一－骨骼肌的AdipoR1、AdipoR2在NASH发病中的表达变化目前仍不明确。我们的研究结果显示：与正常组大鼠相比，NASH模型组大鼠的肝脏、内脏脂肪组织AdipoR1、AdipoR2表达下降，骨骼肌AdipoR1、AdipoR2表达上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这种变化对于NASH的发生、发展的意义值得探讨，我们推测可能产生的机制及意义为：肝脏通过主动下调脂联素受体表达减少脂联素的生物学效应，减少肝脏脂肪酸氧化及葡萄糖摄取，导致肝脏脂肪沉积，从而主动参与NASH发病；内脏白色脂肪组织主动下调脂联素受体表达减少脂肪酸氧化及葡萄糖摄取，从而脂肪重新分布导致腹型肥胖；骨骼肌组织脂联素受体上调表达可能是机体为加快游离脂肪酸氧化分解及葡萄糖摄取而产生的代偿性高表达。另外Civitarese 等[8]报道人骨骼肌中AdipoR1（r= 0.64，P=0. 004）和AdipoR2（r=0. 47，P=0. 048）的表达水平与胰岛素敏感性呈正相关。Inukai等[9]认为胰岛素对AdipoR1的表达有抑制作用，提示胰岛素及胰岛素抵抗可能对AdipoR1、AdipoR2的表达具有调控作用。故NASH发病中，脂联素受体表达变化的不同是否与组织的局部胰岛素及胰岛素抵抗水平不同有关也值得进一步研究。

其次，研究结果显示：与正常组相比，NASH模型组大鼠的体质量、FPG、TCH、TG、ALT、AST均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明NASH与肥胖、2型糖尿病、血脂异常等代谢综合征组分密切相关，提示NASH与代谢综合征可能有共同的发病基础。目前脂联素受体的调控机制不明，对AdipoRl和AdipoR2的进一步的研究能更好地理解脂联素的作用以及NASH、糖尿病、动脉粥样硬化等肥胖相关疾病的分子机制，从而有可能设计以AdipoRl和AdipoR2作为分子靶点的治疗NASH、糖尿病或动脉粥样硬化的新型药物。

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