用红细胞吸附释放法纯化H9N2亚型禽流感病毒

步卫东

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京100097)

病毒能在活细胞内复制和增殖,因此,病毒培养物中都含有大量的宿主细胞碎片及其亚细胞组分,病毒本身含量偏低。提纯应在不使病毒损伤和失活的前提下,减少非病毒杂质,提出高纯度的浓缩病毒;浓缩、提纯可根据病毒本身特性采取不同的方法。本文利用流感病毒在4℃对红细胞有凝集作用,即流感病毒在0℃～4℃被红细胞表面受体(含唾液酸的糖蛋白)吸附,但在37℃又从红细胞上(神经氨酸酶受体被破坏)游离下来特性,用红细胞对其进行浓缩、纯化[1]。

1 材料和方法

1.1 50%红细胞悬液的制备

健康SPF180 d公鸡3只,翅静脉采血加入两倍量阿氏液抗凝,按红细胞洗涤方法洗涤3次(前2次2 000 r/min离心5 min,第3次离心10 min),弃上清,加9 g/L的生理盐水制成50%的红细胞悬液,4℃保存备用。

1.2 H9N2亚型禽流感病毒的增殖

H9N2病毒液增殖:经国家流感中心鉴定为H9N2亚型的鸡源毒株A/Chick/hebei/98(H9N2),为F2代,常量法HA为29,毒价为107.625EID50/0.1 mL。将种毒进行10—6稀释,10日龄SPF鸡胚,尿囊腔接种0.1 mL/枚,37℃孵化,弃24 h死亡胚,48 h～96 h收获尿囊液,HA测定为29,放于—20℃备用。

1.3 试剂和仪器

9 g/L的生理盐水,1%红细胞悬液,96孔血凝板,恒温水浴锅,8道移液器,4℃冰箱,温箱,生物安全Ⅱ级实验室(京)动防(合)字D05064号。

1.4 病毒粗提

冻融3次的H9N2尿囊液经3 500 r/min离心15 min,吸上清,沉淀的杂蛋白弃掉,收集备用。

1.5 红细胞吸附-释放试验

取经粗提的H9N2病毒尿囊液50 mL,加入已制备的50%的红细胞30 mL,充分振荡混合均匀,放4℃吸附[2],期间分别在1、2.5、4、8 h吸取上清,测定HA效价,并且在1 h、4 h轻轻振荡一次,8 h充分振荡,放4℃过夜,经过16 h～18 h,上清液HA≤24,停止吸附,1 500 r/min离心15 min去上清,沉淀按1∶10(比例按病毒原液体积的1/10计算)加入9 g/L生理盐水5 mL,37℃水浴4 h,期间每隔30 min振荡一次(这期间有可能出现溶血),在1、2、3、4 h吸取上清液100 μ L,测定HA,4 h取出,1500 r/min离心20 min,取上清液,测定HA。

1.6 红细胞凝集特性试验

洗脱下来的红细胞加入9 g/L生理盐水洗涤2次,制成1%的红细胞,按参考文献[2]标准进行H9N2禽流感病毒HA测定。

2 结果

2.1 H9N2禽流感病毒浓缩、提纯和HA测定结果

H9N2禽流感病毒经红细胞浓缩、部分提纯后,HA效价提高了3个滴度,但37℃水浴振荡过程中造成了微量溶血。按考文献[2]标准进行HA测定,在25℃～28℃室温加入1%鸡红细胞悬液,加入10 min后观察结果,可以进行判定,但前4孔平铺孔底的红细胞很快卷曲,下滑。结果见表1。

2.2 提纯H9N2禽流感病毒与洗脱下红细胞凝集特性试验

经红细胞浓缩、提纯后的H9N2禽流感病毒,还能凝集新的鸡红细胞;但洗脱下的红细胞不能凝集H9N2禽流感病毒。

表1 不同时间H9N2禽流感病毒HA测定结果T able 1 H9N2 virus HA titers in different time

3 讨论

本方法利用禽流感病毒4℃对红细胞凝集、37℃释放的生物特性,进行病毒浓缩、提纯,使病毒浓度提高。但浓缩后病毒进行HA测定时,试验前4孔解凝速度加快,分析原因是因为病毒在反复试验中增加了温度反应的敏感性,致使神经氨酸酶(受体破坏酶)解凝作用近一步加强。同时洗脱下来的红细胞包膜表面神经氨酸酶受体被破坏,因此失去了凝集流感病毒的能力。

禽流感H9N2病毒经红细胞提纯后,病毒血凝价提高3个滴度,结果与曹康等[3]的试验结果基本一致。同时用3只健康SPF公鸡血混合制备提纯红细胞悬液,可避免红细胞非特异凝集反应发生和其他病毒污染。结果证明该方法是可行的。

此方法只用50 mL鸡胚尿囊液就获得15 mL HA效价提高23倍的纯化流感病毒,表明该方法可节省病毒鸡胚尿囊液的用量,纯化效率高。同时对设备要求不高,因此是一种经济实用的纯化流感病毒的方法,值得推广。

[1] 殷 震,刘景华.动物病毒学[M].北京:科学出版社,1997:308.

[2] 郭元吉,程小雯著.流行性感冒病毒及其实验技术[M].北京:中国三峡出版社,1997:143-144.

[3] 曹 康,张卫东,施桥发.等.两种纯化流感病毒方法比较研究[J].河北医科大学学报,2005,26(3):178-181.