基于冰核蛋白的狂犬病毒糖蛋白细菌表面展示*

郭 恒,刘 娟,李慧萍,王学林,孙树民,张茂林,高丽芳,徐德启,2,刘明远*

(1.人兽共患病研究教育部重点实验室,吉林大学人兽共患病研究所,吉林长春130062;2.美国食品与药品管理局(FDA),美国马里兰20892)

狂犬病及其导致的死亡是目前我国最为严重的公共卫生问题之一。动物狂犬病,尤其是犬狂犬病的流行,是我国人狂犬病发生的根本原因[1]。接种疫苗是控制动物狂犬病发生和流行的最有效手段。目前,国产兽用狂犬病疫苗仍以传统弱毒活疫苗为主,而灭活疫苗又尚未实现国产化,使用成本较高。因此,开发符合我国国情和狂犬病流行特点的廉价、使用方便、安全性高的新型狂犬病口服疫苗将对从源头上控制狂犬病在我国的流行产生深远影响。

冰核蛋白(ice-nucleation protein,INP))是丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的外膜蛋白,可加速纯水的冰晶形成。INP通过糖基磷脂酰肌醇(glucosylphosphatidylinositol,GPI)而锚定在细菌表面,利于大分子蛋白的表面呈现[2]。GPI锚定系统很少发现于原核生物中,广泛用于真核表面蛋白如酵母a-凝集素和哺乳动物表面蛋白的锚定。目前使用INP已在大肠埃希菌[2]、沙门菌[3]、鳗弧菌[4]、恶臭假单胞菌[5]、蓝细菌[6]等革兰阴性菌表面成功展示多种蛋白。本试验拟在大肠埃希菌工程菌中初步验证我们构建的冰核蛋白展示系统,为进一步研制基于沙门菌的多抗原表位展示性重组疫苗、新型狂犬病疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、毒株和质粒 人用狂犬病毒CTN疫苗株由张茂林博士惠赠,大肠埃希菌(E.coli)JM109、BL21(DE3)、荧光假单胞菌、Vero细胞、pET28a(+)载体由实验室保存,pMD-18T载体购自TaKaRa公司。

1.1.2 主要试剂 NcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、T4DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒购自MBI公司,AMV反转录酶、RNA酶抑制剂购于Promega公司;Taq DNA聚合酶、DNA标准(DL2000)、中分子质量蛋白标准购自宝生物工程(大连)有限公司,Trizol购自Invitrogen公司,鼠源狂犬病毒单抗Rab-50、辣根标记羊抗鼠二抗购自Santa cruz公司,基因组及质粒提取试剂盒购自V-gene公司。

1.2 方法

1.2.1 冰核蛋白N末端序列的PCR扩增 以荧光假单胞菌基因组DNA为模板,设计并合成引物如下:INP1:5′-CGC CAT GGA TCT CGA CAA GGC GT T GGT-3′,INP2:5′-CG GGA TCC AAT CAG ATC ACT GTG GT T GCC-3′(下划线部分为酶切位点,下同)。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化回收(具体操作步骤参照DNA凝胶回收试剂盒说明书),连接于pMDl8一T载体构建重组质粒。PCR和NcoⅠ、BamHⅠ双酶切质粒(质粒提取步骤参照质粒小提试剂盒说明书)鉴定正确后送北京华大基因研究中心进行序列测定。测序正确的重组质粒命名为18T-INP。

1.2.2 狂犬病毒CTN株G蛋白序列的PCR扩增根据GenBank中收录的CTN株序列设计引物如下:CTN-G1:5′-CGG GAT CCA A AT TCC CCA TT T ACA CGA TAC C-3′,CTN-G2:5′-CCC TCG AGT TAC AG C TTG GTC TCA CCT -3′。使用Trizol从感染狂犬病毒CTN-30株的Vero细胞培养液中直接提取总RNA,使用AMV逆转录酶在42℃60 min下逆转录合成G基因的cDNA,进而扩增G基因,并按1.2.1方法构建重组质粒18TRVG。

1.2.3 重组表达载体的构建 将质粒18T-INP用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切,回收目的片段。该片段与相同酶切的pET28a(+)载体片段16℃在T4 DNA连接酶作用下连接2 h,转化至表达宿主菌BL21(DE3)中。按1.2.1方法进行阳性菌筛选、鉴定等,重组质粒命名为pET28a-INP。BamHⅠ和XhoⅠ双酶切质粒18T-RVG,同法将回收的目的片段插入pET28a(+)和pET28a-INP载体相应位点,构建重组表达载体pET28a-RVG和pET28a-INPRVG并转入BL21(DE3)菌中。

1.2.4 重组载体的表达 将鉴定正确的重组菌分别按1∶100接种于新鲜的含卡那霉素的LB液体培养基中,振荡培养至吸光度(OD600)为0.4～0.6时,加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L,16℃诱导培养12 h,以空载体pET28a转化BL21(DE3)菌为阴性对照。分别收集1 mL菌液离心弃上清,重悬于4×SDS-PAGE上样缓冲液中,煮沸变性5 min,6 000 r/min离心5 min后120 g/L SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。

1.2.7 整体细胞ELISA 将细菌悬浮于PBS中并稀释至OD600=1.0,包被微量滴定板100 μ L样品4℃过夜。过多的细胞被去除,200μ L含50g/L BSA的PBS 37℃包被1 h,去除封闭液后,洗3遍,1∶1 000鼠抗RV单克隆抗体Rab-50孵育1 h(37℃)。PBS洗3遍后,1∶10 000辣根标记的羊抗鼠二抗孵育1 h(37℃)。含0.05%Tween-20的PBST洗3遍,TMB solution显色。2 mol/L H2 SO4终止反应,450 nm测光吸收度(Bio-Rad,Hercules,CA)。

2 结果

2.1 基因的克隆

以提取的丁香假单胞菌基因组为模板,扩增出N端截断的INP cDNA片段。以提取的狂犬病毒CTN株总RNA为模板,RT-PCR扩增出不含信号肽序列的G基因的cDNA片段。10 g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示分别约为600 bp和1 500 bp左右(图1),与理论值(609 bp和1 518 bp)相符。INP序列测定结果表明,本研究所克隆的INP基因与华东理工大学张元兴教授克隆的丁香假单胞菌MB03株的冰核蛋白(inaQ)核酸同源性最高,一致性为96%,有5处核苷酸存在差异,并导致两处氨基酸发生变化。我们比较了这两种冰核蛋白展示外源蛋白的效果未见有明显差异(未发表)。CTN-G序列测定表明其与GenBank中注册的序列一致,没有发生突变。

图1 INP和CTN-G基因PCR扩增结果Fig.1 The amplified results of INP and Rabies virus glycoprotein by PCR

2.2 重组载体的构建

将PCR产物与pMD-18T载体连接,PCR和双酶切鉴定正确后将相应的片段插入原核表达载体pET28a(+)中,构建重组表达载体pET28a-INPRVG。该载体质粒分别以NcoⅠ/BamHⅠ、BamHⅠ/XhoⅠ、NcoⅠ/XhoⅠ进行酶切鉴定,可得到对应的约600、1500、2 010 bp的特异切割带(图2),与理论值相符。

图2 pET28a-INP-RVG质粒双酶切鉴定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.3 重组载体的表达

pET28a-INP、pET28a-RVG、pET28a-INPRVG重组质粒转入大肠埃希菌BL21(DE3)宿主菌中,16℃诱导培养12 h后菌体裂解物经SDSPAGE,分别在24、56 ku、77 ku处出现明显的蛋白表达带,而pET28a-INP-RVG重组菌还可在56 ku观测到较弱的蛋白带,而未诱导及非重组pET28a对照菌均无特异性蛋白带,与理论相对分子质量(24.1、56.6、77.8 ku)相符(图3)。

图3 重组质粒表达产物的SDS-PAGE检测Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein

2.4 蛋白表面展示的初步鉴定

整体细胞ELISA用于对细胞表面展示蛋白情况进行鉴定。含pET28a-INP、pET28a–RVG、pET28a-INP-RV质粒的大肠埃希菌诱导表达后直接包被微量滴定板,测得的OD450值分别为0.023 8、038 8和0.165 4(图4)。相对来说,含pET28a-INPRVG质粒的重组菌有更高的吸光度值(分别约是前者的4倍和7倍)。由于使用的是未经破碎的诱导后的完整大肠埃希菌进行包被,只有表面展示病毒保护性抗原的重组菌才可被狂犬病毒糖蛋白单抗Rab-50识别,说明我们构建的重组蛋白成功展示在细胞表面。

图4 整体细胞ELISA结果Fig.4 Whole-cell ELISA of recombinant cells

3 讨论

在活细菌表面展示外源蛋白在微生物学、分子生物学、免疫学和生物工艺学方面有重要的应用价值。在细菌表面展示外源抗原利于免疫系统识别抗原,在其它细菌表面成分作用下起到间接免疫佐剂的作用。大多数展示系统展示的外源抗原大小受限制,同时展示多亚基抗原较难成功。而INP细胞表面展示系统因其展示外源蛋白大、稳定、安全、检测方便等特性近年来引起了更多的关注。INP含圆柱状的中央重复区,其在冰晶的形成过程中起催化作用,而其对膜的锚定是非必须的,因此可用作一个模块空间来控制外源蛋白和细胞表面之间的长度。当INP表达于细胞表面时,集聚的INP形成糖脂蛋白(glycolipoprotein)复合物,抵抗蛋白酶降解,保持在静止期的安全性。表达的INP融合蛋白并未导致膜结构的破坏或宿主生长的障碍,因此INP能在细胞表面过量表达大分子异源蛋白(如90 ku[7])。INP包含3个结构域,即N端独特区(CRD),中央重复区,C端特殊区。N端由175或179个氨基酸组成,可通过膜-插入信号肽序列锚定到外膜上;圆柱状的中央区由重复的8-,16-,48-残基组成,其在冰晶的形成过程中起催化作用;C端由49个aa组成,亲水并定位于细胞外。目前,基于INP的细菌表面展示系统有多种构建方法,主要取决于外源蛋白融合的部位。虽然融合到C端、N端(保留不同数目的重复单元)或二者之间均取得了很好的效果,为尽量降低载体的体积,我们将G蛋白插入到截断的N端区,同时为避免展示的蛋白间的潜在的立体空间障碍,又保留了两个重复亚基(32 aa),初步实验显示基于冰核蛋白的细菌表面展示系统构建成功。

孟胜利等[8]研究发现人用狂犬病毒CTN疫苗株与我国分离的街毒株糖蛋白的核酸和氨基酸同源性最高。本实验提取CTN-30病毒总RNA,RTPCR方法成功克隆到G基因片段,序列分析表明与CTN-1株序列一致,未出现突变。狂犬病毒的糖蛋白G是病毒与宿主细胞结合的配体,介导了病毒与靶细胞的结合及在神经系统的分布。其不但与病毒的毒力、致病性密切相关,而且是狂犬病毒的主要保护性抗原,能刺激机体产生中和抗体,保护机体抵抗病毒的感染。狂犬病毒的糖蛋白G含有糖基化位点,直接使用原核表达系统用于疫苗的构建是不适合的,但展示表位将不存在该问题的困扰。目前G基因的中和线性表位已被插入到犬腺病毒2型载体中[9],显示了很好的应用前景。由于T7表达系统是非常成熟的原核表达系统,我们在大肠埃希菌工程菌中对构建的表面展示系统进行验证后,将构建一种表面展示狂犬病毒中和线性表位的减毒鼠伤寒沙门菌,并最终将其用于新型狂犬疫苗的运载体。

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