乌连止泻颗粒剂中挥发油提取和包合工艺研究

李继昌，于文会，张秀英，侯振中，徐 利，姜晓文，徐倩倩

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030；2.哈尔滨市和平兽药有限公司，哈尔滨 150039）

犊牛腹泻可由细菌、原虫、病毒或以上因素混合感染引起，是引发奶牛和肉牛死亡的主要原因，能造成巨大的经济损失[1-2]。本病一年四季均可发生，尤其以初春及夏末秋初多发，特征是拉稀、呕吐、脱水和体重减轻。如临床诊治不当，不仅幼畜的生长发育受阻，而且极易死亡。近年来发病率和死亡率不断增高。目前该病治疗主要以抗生素为主，但因其毒副作用而易致幼畜脏器损害，使病情加重。长时间应用抗生素还会导致耐药性的产生。中兽医学认为，犊牛为稚阳，稚阳之体气血未充，脏腑娇嫩，脾胃素弱，因而脾常不足。如饲养管理不当，寒热不调以及风寒暑湿所侵，致使脾胃功能失调而发生腹泻[3]。中兽药是应用中兽医学扶正祛邪的治疗原则和现代医学整合调整理论，重在调节机体自身免疫力，兼有抑菌、消炎、止痛等效用，标本兼治，尤其在减轻细菌耐药性和抗生素副作用等方面具有西药无法比拟的优势。乌连止泻颗粒剂由乌梅、黄连、白术、木香、干姜、甘草组成，是用于治疗犊牛腹泻病的纯中药制剂。其中黄连清热、燥湿、解毒、泻火[4]；乌梅敛肺涩肠、生津止渴、驱虫止痢，白术健脾益气、燥湿利水；干姜温中散寒、回阳通脉、燥湿消痰；木香行气止痛、健脾消食；甘草补益中气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、缓和药性[5]。六药合用，共奏扶正祛邪、清热解毒、杀菌抗菌、理气健脾之功效[6-7]。本文对乌连止泻颗粒剂中干姜、白术、木香、甘草含有的挥发油成分提取和包合工艺进行了研究，旨在为提高挥发油的有效溶出和增加其稳定性提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

干姜、白术、木香、甘草均购于黑龙江省药材公司。

1.2 挥发油提取条件的优选

1.2.1 加水量考察

分别称取白术、干姜、木香、甘草各60 g，混匀，均分为3份，分别加入6、8、10倍量的水，共水回流冷凝法提取挥发油6 h，记录挥发油得量。

1.2.2 浸泡时间考察

分别称取白术、干姜、木香、干草各60 g，混匀，均分为3份，加8倍量水后分别浸泡0、4、8 h，共水回流冷凝法提取挥发油6 h，记录挥发油得量。

1.2.3 提取时间考察

分别称取白术、干姜、木香、甘草各20 g，加8倍量水，共水回流冷凝法提取挥发油，并记录每小时出油量。

1.2.4 药材粉碎度考察

分别称取白术、干姜、木香、甘草各40 g，混匀，均分为2份（分别为未粉碎饮片和粗粉），加8倍量水，共水回流冷凝法提取挥发油，并记录每小时出油量。

1.2.5 挥发油提取率考察

取白术、干姜、木香、甘草各20 g，加8倍量水，按上述筛选最佳条件共水回流冷凝法提取挥发油6 h，共3批，计算挥发油的出油率。

1.3 包合工艺研究

1.3.1 β-CD包合挥发油的正交试验

根据预试验结果和文献资料报道，选择β-CD（β-环糊精）∶挥发油、β-CD∶水、包合温度和包合时间为考察因素，用L9（34）进行正交试验，并以包合物收得率和挥发油利用率作为考察指标以筛选优化水平条件，挥发油包合工艺因素水平见表1。

表1 挥发油包合工艺因素水平表L9（34）Table 1 Experimental factors and levels L9(34)of volatile oil clathration technology

1.3.2 包合物制备

按表1进行正交试验，精密称取β-CD适量，置于250mL具塞三角瓶中，加入适量蒸馏水，沸水浴中加热使溶解，降至规定温度，于磁力搅拌器上恒温搅拌30 min，精密量取挥发油适当体积，按1∶10用无水乙醇稀释，将其注入含β-CD溶液中，加塞，恒温搅拌至规定时间。置4℃冷藏12 h，抽滤，用石油醚25mL洗涤3次，真空干燥24 h即得粉末。

1.3.3 包合物中挥发油及空白回收率的测定

将制得的包合物置250mL圆底烧瓶，加入蒸馏水100mL，参考文献[8]测定包合物中实际含油量和挥发油空白回收率。

1.3.4 包合物质量检查

采用电子显微镜观察包合物的性状。应用薄层色谱法检查包合物的质量:①供试液1的制备:称取包合物适量，提取挥发油，取挥发油0.5mL，加无水乙醇0.5mL，作供试液1；② 供试液2的制备:称取包合物1 g，用无水乙醇2mL溶解，振摇过滤，滤液作为供试液2；③阳性对照溶液的制备:取包合前白术、干姜、木香、甘草混合提取挥发油0.5mL，加无水乙醇0.5mL，做供试液3。④TLC鉴别:取供试液1、2、3对照溶液各2μL，共3份分别点样于同一硅胶GF 254板上，分别用展开剂 1，环己烷∶苯∶乙酸乙酯（70∶15∶15）；展开剂 2，石油醚∶乙酸乙酯∶苯（70∶15∶15），上行展开18 cm，取出，晾干，再分别喷1%对二甲氨基苯甲醛-硫酸溶液，5%香草醛-硫酸溶液，100℃烘干至显色清晰。

1.3.5 包合工艺验证试验

精密量取挥发油2mL，3份，分别置250mL圆底烧瓶中，按最佳工艺条件包合，测定包合物收得率和挥发油利用率。

2 结果与分析

2.1 挥发油提取条件优选结果

2.1.1 加水量考察结果

由表2可知，药材加水量为6倍投药量时的挥发油提取量较加水8、10倍时低，且易糊化，故不选择。加水量为8、10倍投药量时，挥发油提取量基本无差异。考虑生产实际，故挥发油的加水量定为8倍投药量。

表2 加水量对挥发油提取量的影响Table2 Effects of imbination amount to volatile oil extraction ratio

2.1.2 浸泡时间考察结果

由表3可知，药材浸泡与否对提取挥发油量基本没有影响，故药材不用提前浸泡。

2.1.3 提取时间考察结果

表4显示，提取6 h时挥发油提取率已达98.4%，故将提取时间定为6 h。

表3 浸泡时间对挥发油提取量的影响Table3 Effects of soak time to volatile oil extraction ratio

表4 提取时间对挥发油提取量的影响Table4 Effects of extracting time to volatile oil extraction ratio

2.1.4 药材粉碎度考察结果

由表5可知，挥发油提取最佳工艺为药材粉碎成粗粉，加8倍量水，不浸泡，提取6 h。

2.1.5 挥发油提取量考察结果

取白术、干姜、木香、甘草各20 g，加8倍量水，按上述筛选最佳条件共水回流冷凝法提取挥发油6 h，计算挥发油的提取量平均为0.61mL。

2.2 包合工艺试验结果

2.2.1 空白回收率测定结果

经测，挥发油空白回收率为90%。

表5 粉碎与否对挥发油提取量的影响Table5 Effects of crush degree to volatile oil extraction ratio

2.2.2 包合物中挥发油测定结果

挥发油在不同条件下包合正交试验结果见表6。经统计分析可知，对于包合物收得率的影响大小的因素依次为 A＞C＞D＞B，且 A2＞A3＞A1，B1＞B3＞B2，C2＞C1＞C3，D1＞D2＞D3，其中仅 A 因素对包合物收得率有显著差异（P＜0.05）。四因素对挥发油利用率的影响大小依次为 A＞C＞D＞B，且 A2＞A3＞A1，B2＞B1＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D1＞D3。其中 A 因素有极显著影响，C因素有显著影响，故选定A因素的水平为A2；B因素对包合物收得率和挥发油利用率均无显著影响，所以选择经济实惠的B1；C因素确定为C2；D因素对挥发油利用率和包合物收得率均无显著影响，所以选择较为经济的D1。所以挥发油包合的最佳工艺为 A2B1C2D1，即 β-CD∶ 挥发油为 4∶ 1，β-CD∶水为1∶8，包合温度40℃，包合时间为30 min。

2.3 包合物检查结果

2.3.1 电子显微镜检查结果

按照验证工艺，不加挥发油制备空白β-CD，为无色半透明片状规则晶体。添加挥发油的包合物为含有淡黄色不规则团块状物质。

2.3.2 薄层层析检查包合物包合效果

阳性对照液和供试液均能清楚见到主斑点，而阴性对照液无斑点，说明挥发油被包合并且其主要成分未发生变化。

2.3.3 包合工艺验证结果

按最佳包合工艺验证3批，其包合物收得率、挥发油利用率稳定，说明该工艺较稳定，结果见表7。

表6 挥发油包合工艺正交试验Table6 Form of orthogonal experiment of volatile oil clathration

3 讨论与结论

3.1 挥发油提取主要影响因素

乌连止泻颗粒剂中白术、干姜、木香含有效成分挥发油，在生产中单独提取每味药是不经济的。李孝栋等报道[9]，白术、干姜同时提取，对二者挥发油的溶出有促进作用。在预试验中采用直接测定挥发油提取量确定对提取量的影响；薄层色谱法检测药物主要成分主斑点确定对挥发油性质的影响，发现三种药物同时提取并不影响溶出率。甘草本身并不含有挥发油，本试验选用甘草与以上三味药同时提取挥发油，发现甘草并不影响挥发油的溶出，反而对挥发油有一定的稳定作用，所以试验选择甘草与白术、干姜、木香同时提取挥发油，起到调和诸药作用。另外，药材粉碎与否对挥发油的提取影响较大。直接用中药饮片提取挥发油仅有少量挥发油，无法收集，而粉碎后提取量显著增加。但粉碎过细药粉容易糊化，不利于挥发油溶出，也会损坏挥发油提取器。故试验采用粗粉进行提取。

3.2 包合工艺影响因素

有文献报道，制备颗粒剂时可将挥发油喷洒于颗粒剂表面，浸透一段时间，以使挥发油透入颗粒剂内部，但挥发油本身有易挥发特性，且在常温条件下易被氧化变性，从而影响药效。β-CD安全、低毒，在胃内不被分解破坏，肠道内分解为低聚糖，对于制备颗粒剂是良好的选择。β-CD包合还能够稳定挥发油性质，故本试验选用β-CD包合工艺。

影响包合的因素很多，如稀释挥发油的有机溶剂、β-CD与水的比例、环糊精与油的比例、包合的方法等。预试验中，曾采用研磨法、超声法、搅拌法进行挥发油的包合。研磨法中β-CD直接与2～5倍量水研匀，β-CD在显微镜下观察为不规则团块状物质，并未发现形成晶体，其包合率很低，且包合物质地坚硬，不适宜作颗粒，故不采用此法。超声法与搅拌法均能形成晶体，包合率和包合物质地也无大差异，但超声法所得包合物，薄层层析鉴别包合物挥发油时发现，其主斑点不清晰，可能是超声对药物的化学结构有一定破坏作用，所以本试验选用搅拌法包合。

[1]Janke B H.Symposium on neonatal calf diarrhoea[J].Veterinary Medicine,1989,84:803-810.

[2]Paul P S,Lyoo Y S.Immunogens of rotaviruses[J].Veterinary Microbiology,1993,37(3-4):299-317.

[3]周志平.中药止泻散治疗新生犊牛腹泻[J].畜牧与兽医,2001,33(6):44-45.

[4]孟倩,李继昌,柳颖,等.抗仔猪腹泻中药口服液的质量标准研究[J].东北农业大学学报,2008,39(5):90-93.

[5]梁冰,杨爱馥,黄凤兰,等.甘草属（Glycyrrhiza）化学成分及药理作用研究进展[J].东北农业大学学报,2006,37(1):115-119.

[6]徐倩倩,李继昌,李永科,等.中草药对犊牛腹泻主要病原菌体外抑菌试验[J].中国奶牛,2008,7:31-33.

[7]徐倩倩.犊牛腹泻中药颗粒剂组方筛选及制备[D].哈尔滨:东北农业大学,2008.

[8]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇〇五年版二部[M].北京:中国农业出版社,2005:附录47.

[9]李孝栋,潘卫三,吴立军,等.干姜和白术挥发油提取工艺[J].沈阳药科大学学报,2003,20(1):45-47.