肉中两种致病菌的双重PCR检测方法的建立

赵燕丽，许 岩，张立钢，杨秀芹，邵美丽*

（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；2.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

爆发的食源性疾病案例多数是由细菌性致病菌污染食品引起的[1]。单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌是两种重要的致病菌，其中以对肉及肉制品的污染最为严重[2]。目前对致病菌的检验大多仍沿用传统的对残余食物的细菌培养及鉴定方法，操作繁琐，耗时耗力，且敏感性也较低[3]。在突发事件时，不能满足检测快速、准确、灵敏度高的要求。近几年，诸如单增李斯特菌[4-6]、金黄色葡萄球菌[7-9]等致病菌的单重PCR检测方法已被建立起来。但鉴于这些方法只能针对食品中单一致病菌进行检测，而食品中往往同时存在多种致病菌，所以在单重PCR的基础上发展了多重PCR技术且有了很大进展[10]。如赵新等建立了多重PCR对乳中沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的同时检测方法[11]，王娜等已用多重PCR技术实现了对水产品中副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的同时检测[12]。然而目前对肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的同时检测报道很少。本研究以单增李斯特菌的hly基因，金黄色葡萄球菌的nuc基因为研究对象，建立了一种快速、敏感性好、特异性强的双重PCR方法，实现了对肉中这两种致病菌的同时检测。

1 材料与方法

1.1 菌种

金黄色葡萄球菌（S.aureus 26003，S.aureus 4086，S.aureus ATCC12598）、单增李斯特菌（L.monocytogenes 54005，L.monocytogenes 54006，L.monocytogenes 54007，L.monocytogenes C53-3，L.monocytogenes ATCC7466）、大肠杆菌（E.coli C8，E.coli A10）、沙门氏菌（Salmomellae 5217）、志贺氏菌（Shigella 51570）均由东北农业大学食品学院提供。

1.2 待测样品

新鲜的猪腹部五花肉来自于附近超市。

1.3 主要试剂和仪器

TaKaRa TaqTM，DL2000 DNAmarker，梯 度PCR仪均购于宝生物工程（大连）有限公司；DYY-6C型电泳仪由北京市六一仪器厂生产；GIS凝胶图像处理系统购于上海天能科技有限公司。

1.4 扩增的目的基因及引物设计

根据GenBank收录的金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc（V01281），单增李斯特菌的溶血素O基因hly（AF253320），通过Oligo 6.0软件设计引物，扩增片段长度分别为168、106bp。引物由上海超世生物科技有限公司合成。引物序列:Primer Sa-F 5'TAGTTGTAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAG C 3'，Primer Sa-R 5'ATTTAACCGTATCACCATCA ATCG 3'Primer Lm-F 5'GGGAAATCTGTCTCAGGT GATGT 3'，Primer Lm-R 5'CGATGATTTGAACTT CATCTTTTGC 3'。

1.5 细菌计数方法及分离鉴定

取用甘油保存的菌液按1%的比例接种于灭菌的含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤培养基（TSBYE）中，37°C恒温过夜培养。将菌液用灭菌生理盐水10倍梯度稀释，将最后三个稀释度分别均匀涂布于 TSA-YE 平板（200μL·板-1），每个稀释度作3个平行，37℃培养24 h，进行菌落记数，取平均值。挑取单个特征性菌落，采用国标法进行单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌鉴定。

1.6 细菌DNA的提取

按照1%比例将菌种接种于灭菌的TSB-YE培养基中，37℃恒温培养13 h，取菌液1mL按照参考文献[13]玻璃珠机械法提取DNA作为模板。

1.7 双重PCR扩增条件的优化

首先在梯度PCR仪上对退火温度进行优化，确定最佳退火温度后，再对Mg2+、模板、引物、Taq酶及dNTPs浓度进行正交试验L16（45），进而筛选最优的PCR反应体系。正交试验方案见表1。

1.8 PCR产物电泳检测

用2%琼脂糖凝胶分析PCR扩增产物。

1.9 特异性试验

采用已经建立的最优反应体系和反应条件对5株单增李斯特菌、3株金黄色葡萄球菌、1株沙门氏菌、2株大肠杆菌及1株志贺氏菌进行PCR扩增，以检测引物和反应的特异性。

1.10 敏感性试验

将过夜培养的金黄色葡萄球菌（26003）、单增李斯特菌（54007）及两种菌的混合菌液，分别用灭菌生理盐水进行10倍梯度稀释，使金黄色葡萄球菌的终浓度为108～100cfu·mL-1，单增李斯特菌的终浓度为108～100cfu·mL-1，混合菌液中两种菌的终浓度均为107～100cfu·mL-1。然后各取 1mL菌液提取基因组DNA作为PCR反应模板。采用最优的PCR反应条件进行单重和双重PCR敏感性检测。

1.11 人工模拟肉样的制备及敏感性检测

在人工污染前，样品按国标法检测证实不含有金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。取肉样25 g加入225mL灭菌生理盐水，匀浆。将过夜培养的金黄色葡萄球菌（26003）、单增李斯特菌（54007）两种菌液混合，然后以匀浆液作为稀释液对混合菌液进行10倍梯度稀释，使两种菌的终浓度均为107～100cfu·mL-1。然后各取 1mL 人工污染的匀浆液，按上述1.6所述方法提取DNA，采用最优的双重PCR反应体系及反应条件进行PCR扩增，以确定人工模拟肉样中两种菌的最低检出限。

2 结果与分析

2.1 双重PCR扩增条件优化

2.1.1 退火温度优化

根据退火温度应比引物Tm值低3～5℃的原则，在梯度PCR仪上选取53.8、54.6、55.5、56.5、57.4、58.4和59.4℃等7个温度，进行最佳退火温度的优化。结果显示，在57.4℃时，引物之间的相互竞争和相互影响最小，扩增效果最佳。所以后续试验的退火温度均选取57.4℃（见图1）。

2.1.2 正交试验优化结果

根据确定的退火温度，在各反应物质浓度范围内做一正交试验L16（45），试验方案10为最优，结果如图2所示。

图1 退火温度的优化Fig.1 Optimization of the annealing temperature

图2 正交试验优化Fig.2 Optimization of orthogonal experiment

通过退火温度和L16（45）正交试验的优化，筛选出的双重PCR最佳反应体系为:10×Buffer 2.5μL，Mg2+（25 mmol·L-1）2.5μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.4μL，dNTP Mixture（各 2.5 mmol·L-1）1.0μL，模板DNA 1.0μL（0.1μg），上、下游引物（10μmmol·L-1）各1.25μL，用灭菌去离子水补至25μL。其反应条件为:94℃预变性5 min、94℃变性30 s、57.4℃退火30 S、72℃延伸1 min，共进行35个循环，最后72℃终延伸7 min，4℃保存。

2.2 特异性检测结果

结果见图3。

特异性检测结果表明，5株单增李斯特菌和3株金黄色葡萄球菌均出现了目的条带，而其他非目标菌及去离子水阴性对照均未出现扩增，且引物间无交叉反应，说明引物及反应均具有较强特异性。

图3 PCR特异性分析Fig.3 Specific analysis of PCR

2.3 单重PCR敏感性检测结果

对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌分别进行敏感性分析，结果表明，二者的敏感性均为101cfu·mL-1（见图4）。

2.4 双重PCR敏感性的测定

对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌进行双重PCR敏感性分析，结果表明，金黄色葡萄球菌敏感性为101cfu·mL-1，单增李斯特菌的敏感性为102cfu·mL-1（见图5）。

2.5 人工模拟肉样中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌最低检出限的确定

通过对人工模拟肉样中两种菌的敏感性进行检测分析，结果表明，金黄色葡萄球的最低检出限为102cfu·mL-1，单增李斯特菌的最低检出限为103cfu·mL-1。

图4 单重PCR敏感性Fig.4 Sensitivity of single PCR

图5 双重PCR的敏感性检测Fig.5 Sensitivity of duplex PCR

图6 人工模拟肉样中双重PCR检测Fig.6 Duplex PCR detection of artificially simulative meat

3 讨论与结论

PCR扩增的最适宜条件，随引物的不同而不同，因而要建立一个良好的PCR体系，首先必须探讨最适dNTPs、Mg2+、引物、模板和酶的浓度，退火温度的选择也直接影响扩增效果[14]。金黄色葡萄球菌编码耐热核酸酶的nuc基因已全部定序，通过nuc基因的特异扩增来检测金黄色葡萄球菌已被证实具有很好的特异性[15]。而单增李斯特菌的hly基因也已被证实具有很好的特异性，且相比inlA基因敏感性较好[16]。本试验以单增李斯特菌的hly基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因，首先在梯度PCR仪上确定最佳退火温度，然后设计正交试验L16（45）优化反应体系，建立了这两种菌的双重PCR检测方法，该法具有很好的特异性和敏感性。且通过单重PCR敏感性和双重PCR敏感性比较，发现在双重PCR中单增李斯特菌的敏感性稍有降低。这一结果与王娜等用建立的多重PCR方法对水产品中副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌进行检测的研究结果相似[12]。这种情况的出现是由于多重PCR反应中存在不同基因片段扩增的竞争抑制现象，若多对引物物的比例不合适，或者对退火温度的要求不一样，可能会导致其中一个目的基因片段优先扩增，而另一目的片段的扩增受抑制[17]。

进一步本试验将建立的双重PCR检测方法应用到人工模拟的肉样中，结果表明该法对两种菌的最低检测限分别为金黄色葡萄球菌102cfu·mL-1和单增李斯特菌103cfu·mL-1，其敏感性与王艳君等建立的多重PCR方法检测单增李斯特菌的敏感性相当，金黄色葡萄球菌的敏感性有所提高[18]。这种敏感性满足细菌的浓度为106～108cfu·mL-1或106～108cfu·g-1才能引起食物中毒的条件[19]，也满足多数管理条例要求的一些食物中细菌不得高于102～103cfu·mL-1或 102～103cfu·g-1的要求。此外，肉中金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的最低检出限均高于细菌纯培养的最低检测限，可能是由于PCR反应容易受到食品基质、培养基成分的干扰。特别是食物成分会抑制反应的顺利进行。尤其是肉及肉制品中的脂肪、淀粉、胶原蛋白、金属离子以及其他蛋白质等的存在,强烈抑制PCR反应，大大降低了检测肉及肉制品中的致病菌的敏感性[20]。

本试验建立的双重PCR检测方法与田静等[21]建立的检测肉中金黄色葡萄球菌的PCR方法和李岩等[22]建立的检测肉中单增李斯特菌的PCR方法相比，实现了对肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的同时检测，且该法操作简便，快速，特异性强，敏感性高，为食品中多种致病菌的同时检测奠定了基础。

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