氯胺酮在大鼠体内死后的分布研究1)

王大利,万东方,王 勇,尉志文,王雪彦,贠克明,王玉瑾

氯胺酮(Ketamine)又称凯他敏,在我国俗称“K粉”,化学名为2-邻氯苯基-2-甲胺基-环己酮。氯胺酮作用机制复杂,涉及NMDA受体、阿片类受体、单胺类受体、毒蕈碱受体和电压依赖性钙通道受体等,同时具有中枢兴奋、中枢抑制、镇痛、抗焦虑、麻醉、致幻等作用。医疗上主要用于术前的肌肉松弛剂,全身麻醉的诱导剂、麻醉辅助剂等[1]。氯胺酮滥用已超过30年[2],也有报道利用其投毒的报道[3]。目前对氯胺酮的研究主要集中在作用机制、检测方法[4-9]、生物检材中氯胺酮的检测[10]。与其死因判定有关法医毒物动力学研究报告较少。本实验在前期研究中进行了动态分布和死后再分布研究[11-13],在此基础上进行研究氯胺酮中毒致死大鼠死亡当时体内分布的情况及影响因素。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 仪器 TRACE GC&DSQ气相色谱/质谱联用仪,美国 Thermo Finnigan公司;TRACE 2000 GC气相色谱仪,美国 Thermo Finnigan公司。

气相色谱-质谱联用仪(Finnigan)条件:DB-5毛细管柱(30 m×0.25 m ×0.25μm),EI源 70ev;质量范围:50～650,柱温120μC(1 min)→20μC/min→280μC(8 min);离子源温度:200 μC,传输线温度:250μC,载气:He 1.5m l/min。

气相色谱(Finnigan)条件:DB-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm),柱温为程序升温:120℃(1min)→20℃/min→280℃(8 min);进样口,240℃,分流进样;检测器,NPD,300℃;空气60 KPa;氢气2.3 KPa;载气,高纯氮气 1.5 m l/min。

试剂:氯胺酮标准品(2 mg/m L由中国公安部二所提供);氯胺酮针剂(3%,江苏嘉隆化工有限公司,产品标准号:HG 3622-1999)。

1.2 动物模型 雄性Wistar大鼠12只,体重200 g±20 g,随机分2LD50组和4LD50组,每组6只,实验前隔夜禁食。经灌胃匀速注入氯胺酮针剂17.28×10-3m l/g(2LD50)和氯胺酮针剂34.55×10-3m l/g(4LD50)氯胺酮。迅速解剖动物,取心样冷冻保存,碱性无水乙醚提取,气相色谱质谱法定性、气相色谱定量检测。

1.3 样品提取和检测 取固体检材1 g或血1 m L,加蒸馏水1 mL,加入内标液(SKF525A)10μL,振荡,固性检材超声细胞粉碎(JYD-650L智能型)匀浆3 min,10%NaOH调酸p H 11～13,振荡摇匀,加入5 mL无水乙醚,振荡15 min,1800 r/min离心10 min,将上清液移入另一干净干燥试管中,重复萃取一次。40℃恒温水浴中挥干,20μL无水乙醇定容,取1μL进样检测,保留时间定性,内标法和工作曲线法定量。气相色谱-质谱联用定性。

1.4 工作曲线 分别取空白大鼠肝脏1 g或血1 m L,分别加入氯胺酮标准溶液及SKF525A内标溶液,配制成含有氯胺酮1 μg/g、2μg/g、4μg/g、8μg/g、16μg/g、24μg/g、48μg/g、64μg/g(或μg/m L),SKF525A20μg的系列样品,按样品提取检测方法进行。以氯胺酮浓度(μg/g)为横坐标(X),氯胺酮与内标SKF525A的峰面积之比为纵坐标(Y)进行线性回归,所得线性回归方程(肝脏)Y=1.203X-0.54,r2=0.9811、(血液)Y=1.357X+1.158,r2=0.9962,结果表明,肝及血中氯胺酮在1μg/g～48μg/g(或μg/mL)范围内线性关系良好。

1.5 回收率 空白肝及血液分别加入氯胺酮标准溶液4μg、16 μg、48μg,工作曲线法计算检材中氯胺酮含量,肝及血液的提取回收率分别为(95.8±5.4)%～(118.3±6.2)%、(97.8±2.4)%～(128.3±3.2)%。

1.6 统计学处理 应用 SPSS 11.5软件,行方差分析及t检验,以均数±标准差(±s)表示。

2 结 果

2.1 2LD50组和4LD50组大鼠体内氯胺酮的死后分布(见表1)

表1 氯胺酮在大鼠体内死后分布(±s)

表1 氯胺酮在大鼠体内死后分布(±s)

剂量 心血(μg/m L) 心(μg/g) 肝(μg/g) 脾(μg/g) 肺(μg/g) 肾(μg/g) 脑(μg/g) 肌肉(μg/g)2LD50 9.11±0.35 3.08±1.75 178.81±65.35 18.48±3.64 18.29±9.83 29.99±14.39 302.40±51.07 16.87±8.004LD50 144.51±26.24 121.17±23.78 848.93±63.91 134.02±39.22 415.39±59.47 935.49±14.271197.74±323.02 32.00±6.85

2.2 GC和 GC/M S检测 氯胺酮和SKF525A保留时间分别为7.57 min和9.46 min,峰形对称,可完全分离,溶剂和空白脏器提取内源性杂质对氯胺酮和SKF525A无干扰。详见图1～4。

3 讨 论

本研究建立的氯胺酮染毒大鼠的死后分布模型显示,不同剂量(2LD50、4LD50)氯胺酮灌胃后在10 min～30 min内死亡。此模型简便易复制,可应用于氯胺酮的法医毒物动力学研究[11-12]。

本研究采用GC/MS定性,GC内标法和工作曲线法定量,具有操作简便、快速,定性定量准确的特点[13]。可应用于氯胺酮中毒案件的检验。

本实验结果显示,各脏器组织氯胺酮含量:①2LD50组,脑>肝 >肾 >肺、脾、肌、心血、心;②4LD50 组 ,脑、肾、肝 > 肺 > 心血、脾、心>肌。氯胺酮死后分布不均匀与文献报道一致[13]。影响药物在机体中分布的因素很多,主要有药物的脂溶性、毛细血管通透性、器官和组织的血流量、与血浆蛋白和组织蛋白的结合率等。氯胺酮蛋白结合率低,脂溶性高,可迅速通过血脑屏障,因此其在脑组织中的含量最高,同时也是其作用的靶器官,从而导致主要神经精神症状;氯胺酮主要由肾脏排泄和肾小管对氯胺酮的重吸收可能是造成肾脏内浓度较高的原因;氯胺酮在肝脏中浓度较高可能主要因为其70%～90%在肝脏代谢,存在首关消除也可能是其影响因素。其次,不同剂量对死后分布存在明显的影响。

本实验结果提示,在实际氯胺酮中毒(死)案件中,检材提取以脑、肝、肾最好,可利用其死后分布规律推测血中氯胺酮浓度;其次,由于氯胺酮为碱性药物,易发生死后再分布,故应及时提取检材。

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