荧光定量PCR检测HCMC DNA的临床意义与探讨

李晓峰,张 锐

（1.吉林省人民医院,吉林 长春 130021;2.吉林省肝胆病医院）

本试验采用荧光定量聚合酶链反应（fluorescence quantitativePCR,FQ-PCR）法检测人巨细胞病毒（HCMV）DNA,并探讨其在HCMV感染诊断和治疗中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 120例HCMV总抗体阳性的肝病患者标本来源于我院门诊及住院患者;80例确诊HCMV感染的新生儿标本及146例疑似HCMV感染的孕妇标本来源于长春市妇产科医院。?

1.1.2 试剂和仪器 HCMV-IgM检测试剂盒购自北京肝炎试剂研制中心;PP65抗原检测试剂盒购自中山大学达安基因诊断中心;HCMV-DNA荧光定量PCR检测试剂盒购自中山大学达安基因诊断中心;7000Sequence Detection System核酸扩增仪（深圳匹基公司。

1.2 实验方法

1.2.1 血清HCMV-IgM ELISA法。

1.2.2 PP65抗原 肝素抗凝血,淋巴细胞分离液分离白细胞,按照试剂盒说明书流式细胞仪检测PP65抗原。

1.2.3 FQ-PCR检测血清HCMV DNA 严格按照说明书提取DNA及PCR扩增。每次试验严格按照试剂盒提供的阳性标准品做标准曲线,试验设阴性、阳性及空白对照。

1.2.4 统计分析 对实验数据进行 χ2检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCMV-IgM、PP65抗原和 HCMV DNA检测结果

不同来源标本HCMV-IgM、PP65抗原和HCMV DNA检测结果见表1,其中HCMV总抗体阳性的肝病患者标本HCMV-DNA拷贝数为3.27×103-9.67×108copies/m l;确诊HCMV感染的新生儿标本标HCMV DNA拷贝数为2.38×103-2.12×108copies/ml;疑似HCMV感染的孕妇标本HCMV DNA拷贝数为1.27×103-8.79×108copies/ml。?

2.2 HCMV DNA含量与病情、预后的关系

87例HCMV-DNA阳性肝炎患者中有12例拷贝数大于1.0×107copies/ml,且症状久治不愈。

61例HCMV-DNA阳性的HCMV-IgM阴性的孕妇9例发生了HCMV的宫内传播,17例HCMV-DNA拷贝数大于1.0×107copies/m l。

表1 不同来源标本HCMV-IgM、PP65抗原和HCMV DNA检测结果

54例HCMV-DNA阳性的新生儿中,有8例拷贝数大于1.0×107copies/ml,其中6例症状重,病程长,并伴有智力低下、小头畸形和听力异常等后遗症。

3 讨论

HCMV感染是广泛存在于人群中的一种病毒性疾病,可引起先天或后天性感染,有两种类型,一种为唾液腺的不显性感染或慢性感染而长期存留;另一种为全身性疾病,为巨细胞包涵体病,主要侵犯婴儿。本研究检测不同标本HCMV-IgM、PP65抗原和HCMV-DNA,结果显示226例HCMV-DNA阳性患者中有128例HCMV-DNA-IgM阴性,提示抗体检测作为感染的间接指标,不可避免的存在检测的窗口期问题,只有在感染或者复发后2-4周后才能检测到,阴性结果也不能排除感染,并不适合早期诊断。

巨细胞病毒感染最长用于抗原检测的是抗原PP65,它是HCMV活动性感染的早期标志性产物。Grefte[1]等证实:PP65是有HCMV病毒UL83编码的被膜蛋白,分子量65000,当病毒感染宿主细胞后该抗原即表达,病毒活跃时明显增加。PP65检测是目前检测HCMV活动性感染和指导抗病毒治疗的重要方法,其灵敏度和特异性均较高,但由于方法学上的特殊,完成全过程受诸多因素影响,包括标本必须采集当天处理,因此很难做到高通量检测,抗污染能力也不强,抗原检测受到限制。定性PCR对HCMV的排除率较高,但定性PCR不能区别潜伏感染和活动性感染[2]。

荧光定量PCR是通过荧光信号的定量监测来实现对PCR过程中产物的监测,并精确计算出PCR初始模板量,融合了PCR的敏感性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量等优点。荧光定量PCR与PP65抗原检测有较好的一致性,HCMV-DNA水平与抗原血症水平相对应[3、4]。本研究结果显示87例HCMV-DNA阳性肝炎患者中有12例拷贝数大于1.0×107copies/ml,且症状久治不愈,提示HCMV感染可能是加重肝病且久治不愈的原因之一。146例疑似HCMV感染的孕妇HCMV-DNA检测有85例阳性,提示应用荧光定量PCR检测孕妇血清中HCMVDNA,产前诊断巨细胞病毒感染可靠,有一定的临床应用价值,17例HCMV-DNA拷贝数大于1.0×107copies/m l且发生母婴垂直传播,这说明孕妇体内的HCMV-DNA拷贝数的高低与是否发生垂直感染有一定的关系。61例HCMV-DNA阳性的HCMV-IgM阴性的孕妇9例发生了HCMV的宫内传播提示部分感染孕妇未能检出HCMV-IgM,但不能排除宫内传播,而荧光定量PCR检测HCMV-DNA能早期诊断孕妇宫内感染,预测胎儿感染情况。诊断HCMV感染的新生儿有54例HCMV-DNA阳性,,提示这写新生儿不但感染了HCMV,而且体内有HCMV的复制,孕妇感染后通过胎盘垂直传播壳引起先天性感染。围产期新生儿经产道或母乳及密切接触感染为后天获得性感染,年龄愈小,易感性愈高,症状也愈重。HCMV为细胞内感染,很难被宿主完全清楚,而且HCMV有不同的病毒株,抗体不能保护患儿免受其他病毒株的感染。

综上所述,荧光定量PCR检测可以准确的反映出患者体内HCMV感染及其病毒复制情况,通过病毒复制判断感染的严重程度,指导临床用药和疗效观察,是目前临床最好的推荐方法之一。

[1]Grefte JM,Vander Gun BT,Schmolke S,et al.The lowermatrix protein pp65 is the principal viral antigen preset in peripheral blood leukocytes during an active cytomegalovirus infection[J].Gen Virol,1992,73（3）:2923.

[2]牛艾茹,陈培佳.定量DNA和IgM抗体检测CMV感染[J].中国优生与遗传杂志,2002,10（4）:40.

[3]Gourlain K,Salmon D,Gault E et al.Quantitation of cytomegalovirus（CMV）DNA by real-timePCR for occurrence ofCMV diseasein HIV-infected patients receiving highly active antiretroviral therapy[J].JM iolDiagn,2003,5（1）:15.

[4]Kearna AM,Turner AJL,Eltringham GJAet al.Rapid detection and quantification of CMV DNA in urine using LightCycler-Based FQ-PCR[J].J Clin Virol,2002,24:131.