基因芯片技术在中医药领域中的应用研究

曹 健，周美启，杨 影

（安徽中医学院，安徽合肥 230038）

基因芯片技术是一项融分子生物学、半导体微电子、激光、化学染料、生物住处学等领域各项技术，一次微排列实验可对上千种基因的表达水平、突变和多态性进行快速、准确检测的高新技术，主要包括芯片制备、样品制备、杂交反应、信号检测和结果分析4个主要步骤，是当今微观整体研究的一项最新技术。目前，基因芯片技术主要应用于基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等领域。基因芯片的飞速发展引起世界各国的广泛关注和重视。近年来，应用基因芯片技术在寻找中医证候的基因组、探索针灸作用机制以及研究中药疗效的基因表达谱方面取得了一定的成果。

1 应用基因芯片技术探讨中医证候的本质

中医证候是中医药研究的核心，证候本质的研究是中医现代化研究的热点和难点，如能获得突破性进展，必将使中医理论研究取得质的飞跃。应用现代医学理论和分子生物学技术阐明中医证候本质是实现中医药现代化的基础和关键，具有重大科学意义。中医药在功能基因调控方面具有潜在的优势[1]，通过对足够数量的同一病位或病性患者的基因表达进行分析，建立辨证要素的基因表达谱数据库，再相互组合便可建立证型基因表达谱数据库，以此可作为辨证的客观规范化标准。

杨裕华等[2]应用基因芯片检测了“劳倦过度、房室不节”肾阳虚小鼠模型脑基因的改变情况，研究结果提示，肾阳虚模型小鼠基因表达改变涉及生长激素、泌乳素、促性腺激素、黑色素和脑脂肪酸结合蛋白（B-FABP）相关基因；炎症/免疫、促细胞凋亡相关基因以及影响多巴胺生成的限速酶、影响凝血纤溶机制和精子发育代谢的相关基因。宋洁等[3]观察了“劳倦过度、房室不节”肾阳虚小鼠模型睾丸基因的改变，共筛选出差异表达基因5 505个，其中上调2 425个，下调3 080个。上调基因前百位中已知基因41个，下调基因前百位中已知基因62个，主要涉及细胞结构/功能、物质/能量代谢、信号转导/传递、炎症/免疫、细胞凋亡、转录/翻译、增殖/分化及细胞周期等。潘志强等[4]探索丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路基因在不同证候H22 肝癌荷瘤小鼠肾上腺中的表达特征，结果提示，不同证候肝癌小鼠的肾上腺组织主动参与了MAPK 信号转导过程。杨丽萍等[5]则利用基因芯片数据挖掘的最新技术手段——基因功能模块，从功能模块水平研究虚寒证发生的分子机制，结果发现，用25个差异基因分类样本准确率为93%，用11个功能模块分类样本准确率为87%～100%。认为基于特征功能模块法研究基因表达谱更有利于对疾病的阐释。

2 应用基因芯片技术探讨针灸的作用机制

针灸以其明显的临床疗效已在世界范围内被广泛认可，而基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析手段，可以在一次试验中同时对成千上万个基因进行分析。针刺既然可引起人体多系统、多功能的同步变化，因此可以设想，通过观察不同穴位、刺激方法、频率、强度等，导致有关组织基因转录的差异，从而在分子水平全面而深刻地反映其广泛的作用途径和治疗靶点，探明针刺的作用机制，体现针灸的整体调节作用，完善针灸理论，为临床治疗提供依据和指导。

笔者在既往的实验中，采用结扎冠状动脉前降支法复制大鼠急性心肌梗死模型，比较肺经组与模型组、心经组与模型组、小肠经组与模型组的下丘脑基因表达谱变化。结果发现，与模型组比较，肺经组中大于2倍的差异表达基因（包括EST）有26个下调和57个上调，心经组中有34个下调和190个上调，小肠经组中有97个下调和122个上调。就大于2倍的表达基因而言，仅仅在心经组和小肠经组出现促甲状腺激素释放激素（TRH）基因表达明显上调和促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）基因表达明显下调。认为下丘脑差异表达基因，特别是TRH和CRH 基因表达，可能参与了电针心经、小肠经对急性心肌缺血的保护作用[6-8]。曲怡等[9]应用基因芯片技术研究电针对局灶性脑缺血-再灌注大鼠脑组织基因表达谱的影响，研究结果表明，筛选出的差异表达基因可能参与脑缺血-再灌注后脑损伤的发生及发展过程，并参与了针灸抗损伤的机制。江励华等[10]采用基因芯片技术观察了电针治疗抑郁症的机制，结果表明，电针治疗抑郁症的机制与调控凝血、免疫、炎症反应和凋亡等相关的基因表达有关。

3 应用基因芯片技术探究中药作用机制

中药由于所含有效成分复杂、作用靶点不明确、重现性差，难以用现行生物医学理论解释，严重地制约了中药的现代化发展。基因芯片作为一种高通量、大规模研究基因功能的新技术，能够从基因表达水平上阐明中医药治病的机制。伴随后基因组时代的来临，基因芯片技术平台可以将中药的药性、功能及主治与其对特定模型细胞相关基因表达和调控的影响关联起来，在分子水平上用现代基因组学的理论来解释传统中药理论及作用机制。

3.1 中药单方研究

李昊等[11]应用基因芯片研究藤梨根对胃癌细胞的作用，结果表明，ERBB2、TRAILR2、p53、TNF、Cyclin E 基因的表达改变可能与藤梨根杀伤和诱导胃癌细胞凋亡有关。于华芸等[12]利用基因芯片技术研究寒性中药黄连对正常大鼠肝脏全基因表达谱的影响，结果提示，黄连可上调炎症反应、免疫反应、防御反应相关基因，增强抗感染、防御能力，调控代谢、凋亡相关基因，影响P450 家族成员，发挥代谢抑制、抗感染作用。其后，于华芸等[13]又利用基因芯片技术探讨大黄“清热泻火解毒”作用的分子机制，结果表明，调控机体防御反应、花生四烯酸代谢相关基因表达，可能是大黄发挥“清热泻火解毒”作用的分子机制之一。

3.2 中药复方研究

毛秉豫等[14]观察加味四物汤对自发性高血压大鼠（SHR）的心肌组织基因表达谱的影响。结果表明，阳性基因重叠有18 条，其中高表达的基因有4 条，低表达的有14 条。该方作用靶点较多，可上调或下调SHR 的某些与生物酶、血管活性物质、心肌纤维化、脂肪酸代谢有关基因的表达，这可能是其产生药理作用的重要因素。王刚等[15]利用基因芯片技术对复方丹参滴丸对心肌梗死大鼠基因表达的影响进行评价和研究，基因芯片结果表明，复方丹参滴丸可通过调节Wnt 信号通路等多个基因和信号途径来减少心肌梗死模型大鼠心脏缺血区的心肌损伤。袁丁等[16]观察中药复方小金丹对人肝癌细胞信号转导基因表达的影响，结果表明，小金丹能显著影响SMMC-7721 细胞信号转导基因表达。

3.3 中药有效成分研究

吕纯芳等[17]应用基因芯片研究藏花素对膀胱移行细胞癌T24 细胞基因表达谱的影响，结果发现，3 mmol/L 藏花素作用于T24 细胞48h 引起该细胞系基因表达谱的广泛改变，其中表达差异2倍以上的基因共836个，这些差异表达基因的功能涉及多个方面，最为明显的是与细胞生长调节相关的细胞周期调节基因、细胞凋亡调控基因、DNA 复制相关基因等类型。谭敏等[18]观察补骨脂素对人乳腺癌MCF-7（ER阳性）细胞基因表达谱的影响。结果显示，经补骨脂素作用的实验组细胞样本与对照组细胞样本比较，呈现差异表达的基因有1 113个。其中，表达上调的有456个，表达下调的有657个。差异表达明显的基因主要与细胞凋亡、细胞周期调控、核酸转译调节、转译因子活性、核苷酸转移酶活性、血管收缩调节等有关。黄杉等[19]应用基因芯片技术研究黄芩素对白色念珠菌基因表达谱的影响，结果发现，共有522个差异表达基因，其中，上调基因251个，下调基因271个。差异基因功能主要涉及细胞周期、跨膜物质转运、多药耐药、毒力因子及热休克蛋白等。

4 小结

从基因概念的提出到人类基因组学计划的完成，基因芯片相关技术得到了飞速的发展。目前，基因芯片技术以其具有高通量、简便、微缩、集约化、平行化等优点，而广泛应用于中医药领域，主要体现在：中医证候、中药药效及药理学研究、中药有效成分筛选研究、中药毒性及不良反应研究等方面，在基因组学与中医药学研究之间架起了一座桥梁，为中医药客观化、定量化、标准化研究提供了技术上的保证。虽然基因芯片技术费用相对昂贵，部分芯片特异性相对较低等局限了其在中医药领域的应用，但仍有其广阔的发展和应用前景。

[1]沈自尹.基因科学和21 世纪中医药学的走向[J].上海中医药杂志,2000,(10):7-9.

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[3]宋洁,李震,张丹,等.“劳倦过度、房室不节”肾阳虚小鼠模型睾丸基因芯片研究[J].中华中医药杂志,2010,25(2):213-216.

[4]潘志强,方肇勤,卢文丽,等.基于芯片数据分析丝裂原激活蛋白激酶信号通路基因在不同证候H22 肝癌小鼠肾上腺的表达差异[J].中西医结合肝病杂志,2009,19(1):27-31.

[5]杨丽萍,黄睿,张洛欣,等.用特征功能模块法挖掘一个虚寒证家系的基因表达谱[J].中华中医药杂志,2010,25(5):683-685.

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[15]王刚,崔佩佩,宋生有,等.复方丹参滴丸对急性心肌梗死大鼠基因表达谱的影响[J].药物评价研究,2010,33(2):98-102.

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[17]吕纯芳,罗春丽,冀慧莹,等.藏花素对膀胱移行细胞癌T24 细胞基因表达谱的影响[J].中国中药杂志,2008,33(13):1612-1617.

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