尖吻蝮蛇类凝血酶的研究现状

欧光武，李 威

（汕头大学医学院第一附属医院胃肠外科，广东汕头 515041）

蛇毒类凝血酶(thrombin like enzyme，TLE)是蛇毒中与血浆凝血酶性质相似的一类酶的总称，通常具有精氨酸酯酶活性。它的重要特性是可水解血纤蛋白原为血纤蛋白，但不能激活体内各种凝血因子，具有抗凝、溶栓、去纤、扩张血管、改善微循环等多种功效。蛇毒类凝血酶的研究，国外开展得比较早，已从多种蝮亚科蛇毒中提取出蛇毒类凝血酶。瑞士产止血剂Reptilase就是从巴西矛头蝮蛇毒中提取出的类凝血酶，国内外已广泛用于出血性疾病及手术前后出血的临床防治。

我国正在研究的一种国产新药——注射用尖吻蝮蛇凝血酶具有良好的止血效果。对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的研究，最早是1967年的Cheng HC和Ouyang C等，他们于1971年和1972年相继分离出两个类凝血酶组分，并经动物实验均有不同程度抗凝作用，与国内溶栓药降纤酶相同。1984年中国科学院昆明动物研究所张洪基等[1]分离得到含有4个同工酶的多组分TLE，但无法获得纯品。1993～2005年，唐松山等经12年的努力，从尖吻蝮蛇蛇毒中获得了5个新的类凝血酶，并对其进行了相关的研究。2003年开始该类凝血酶进入临床试验，并取得了良好的临床止血效果[2-3]。2009年从我国内地特有的尖吻蝮蛇蛇毒中提取开发的国家一类新药“苏灵”已经上市。

以下对有关尖吻蝮蛇类凝血酶的理化特性、制备、作用机制、临床应用等方面的研究资料进行总结：

1 尖吻蝮蛇凝血酶的理化特性

尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶是我国开发的一种新药，目前正处于研发、实验阶段，国内虽有多个研究中心对其进行研究，但其理化特性尚未完善。关于尖吻蛇毒类凝血酶的研究主要集中在以下两种：

1.1 双亚基结构的血凝酶

从尖吻蝮蛇毒中分离纯化的双亚基结构的血凝酶，目前国内的研究主要集中在此具有双亚基结构的凝血酶上。普遍认为尖吻蝮蛇凝血酶主要有效成分为4个具有相同功能的凝血酶样酶，该4个同工酶与以往蛇毒类凝血酶的结构完全不同，均为双链结构。由于尖吻蝮蛇蛇毒中的许多分子量、等电点和凝结活性相近的蛇毒蛋白长时间地影响了纯化工艺，所以每个研究中心对蛇毒提出的成分或者纯度不一样，其研究结果尚未能完全统一。分述如下：

1.1.1 2002年，唐松山等从尖吻蝮蛇蛇毒中提纯得到一种具有止血活性的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶，用SDS-PAGE法测得其全分子量为32 kD，由相近两个亚基组成，亚基分子量17 kD和15 kD，该酶最适温度为35℃，最适pH=7.5，等电点为5.9。用酸水解测得该酶由18或20种氨基酸组成，各氨基酸组成为（%）：Asp 为 6.2，Thr为 1.43，Ser为 4.16，Glu 为8.74，Gly 为 2.14，Ala 为 2.15，Val为 2.88，Met为 1.33，I1e 为2.35，Leu 为 2.28，Tyr为 2.45，Phe 为 4.16，Lys为 4.19，His为1.58，Arg 为 1.83，Pro 为 1.8，Cys为 4.34，Trp 为 4.93，NH 为32.68。

1.1.2 2005年，唐松山等再次从尖吻蝮蛇毒中提纯类凝血酶，其等电点为5.51～5.64。该凝血酶分子量为29.3～29.5 kD，由分子量分别为15.0 kD和14.2 kD的亚基A、B以二硫键连接而成，含204个氨基酸。其A亚基N端第1～25位的氨基酸序列为DCSSGWSSYEGHCYKVFKQSKTWTA，B亚基N端第1～25位的氨基酸序列为DCPSDWSSYECHCYKPDEPKTWEDA。

1.1.3 2005年，张艳宇等对尖吻蝮蛇凝血酶的进行克隆分析，推测尖吻蝮蛇凝血酶分子量为26 429，由263个氨基酸组成，理论上的等电点为7.6，其信号肽序列为1～24个氨基酸残基， 成熟肽序列中有 12 个 Cys31、52、68、102、144、165、176、191、202、212、226、258 残基，形成 6 个二硫键，符合 TLE的典型特征；也含有TLE的催化活性中心的保守性氨基酸残基His67、Asp112、Asp200和ser206，其成熟肽N端氨基酸为Val25，这和大多数的TLE是相同的[4]。

1.1.4 2009年，唐松山等对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基进行拆分和氨基酸残基测序，证明了Agacutin是一个15 kD和16 kD亚基组成的异二聚体。大亚基N端15个氨基酸残基序列为DCSSGWSSYEEHQYY和小亚基序列DSSGWSSYEGHEYYV[5]。

1.2 单链糖蛋白

1.2.1 2005年翟宁等[6]从皖南尖吻蝮蛇毒中分离纯化得到一种丝氨酸蛋白酶，该酶分子量为68 kD，但该酶的等电点、pH值结构、氨基酸序列及结构等，目前尚未见相关报道。

1.2.2 2008年，成都军区疾病预防控制中心军事医学研究所郑颖等[7]从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到单链血凝酶，等电点为6.59，其N末端氨基酸序列为VIGGNECDTNEEHFL，与巴西矛头蝮蛇毒来源的血凝酶N末端VIGGDECDINEHPFLA有5个氨基酸不同，具有较高同源性。因而在结构、理化性质上与药品血凝酶注射液中的巴曲酶很相似。

2 尖吻蝮蛇凝血酶的制备

从天然蛇毒中提取的类凝血酶绝大多数为酸性蛋白质，多采用阴离子交换柱进行分离，并结合凝胶过滤、亲和层析和反相液相色谱等方法纯化[8]。常用的阴离子交换剂：DEAE-葡聚糖凝胶、DEAE-纤维素等。葡聚糖凝胶多用G-100、G75作分离。基于蛋白质的疏水性，采用非极性烷基固定相作为填料，采用反相液相色谱可以使类凝血酶有较高的回收率。亲和层析主要运用的是酶与竞争剂特异性相互作用的原理。尖吻蝮蛇凝血酶作为类凝血酶中的一种，目前对该蛇毒凝血酶的提纯及制备仍主要采用该方法[6]。

从蛇毒毒液中分离纯化类凝血酶数量有限，并且常因纯度难以控制而导致其他免疫毒副反应。基于对经济蛇种功能蛋白资源的保护以及解析类凝血酶结构和功能的需要，利用基因工程手段制备大量高纯类凝血酶就显得尤为迫切。2005年，张艳宇等[4]从尖吻蝮蛇毒腺总RNA中通过RT-PCR扩增，获得1个类凝血酶基因，该蛇毒类凝血酶基因的获得为其生物学功能奠定了基础。

3 尖吻蝮蛇凝血酶的作用机制

人血浆纤维蛋白原由3对不同的肽链即α、β、γ组成，每条α链上包含1个A肽，β链上包含1个B肽，故纤维蛋白原可写成[αAβBγ]2。在凝血酶作用下，纤维蛋白原释放出2条A肽和2条B肽，成为纤维蛋白单体(αβγ)2，后者聚合成可溶性多聚体。凝血酶同时激活凝血因子(纤维蛋白稳定因子)促使纤维蛋白分子间形成共价键，以二聚体和多聚体方式交联，成为稳定的、不溶的纤维蛋白多聚体。蛇毒类凝血酶的作用机制与凝血酶完全不同，部分蛇毒类凝血酶仅裂解α亚基的A肽，使纤维蛋白原成为(αBβγ)2；部分蛇毒类凝血酶仅裂解β亚基B肽，使纤维蛋白原裂解成(Aαβγ)2[9]。尖吻蝮蛇凝血酶使纤维蛋白原α亚基裂解出A肽后，产生纤维蛋白单体(αBβγ)2，释放FPB，从而促进纤维蛋白单体的形成及聚合[10]。在聚合过程中，由于尖吻蝮蛇凝血酶不诱导凝血酶Ⅷ因子的释放[11]，生成的纤维蛋白单体只能首尾聚合，而不能纵向聚合，这样形成的聚合体不牢固，生成的纤维蛋白为可溶性的非交联单体，很快会被网状内皮系统吞噬和循环血液清除，因此在体内表现抗凝和溶纤功能[11]，同时类凝血酶对血小板的聚集不起作用，机体仍能保持正常的止血功能；在体外则表现出促凝效果。

凝血酶分子对纤维蛋白原的识别依赖于其外识别位点（fibrinogen recognition exosite，FRE），肝素是 FRE 依赖型抑制剂，可以完全抑制凝血酶活力，但尖吻蝮蛇毒类凝血酶促凝作用不受肝素和AT-Ⅱ的抑制[12]，这与文献报道的肝素治疗浓度不抑制蛇毒凝血酶体内体外促凝活性的结论一致。

4 尖吻蝮蛇毒类凝血酶的应用

尖吻蝮蛇毒类凝血酶具有的生理特性表现为在体外其可作为促凝剂将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，而在体内它们导致良性的降纤效应。这就决定了尖吻蝮蛇毒类凝血酶在未来的临床应用中将主要用于止血、抗血栓两方面，该凝血酶在这两方面的作用有剂量依赖性，在小剂量时显示凝血活性，其大剂量则体现抗凝活性。

4.1 止血作用

目前多项研究表明尖吻蝮蛇凝血酶具有较好的促进全血凝固和止血作用[13-14]。该类凝血酶在血管内只产生纤维蛋白B单体，同时只促进出血部位血小板聚集，而对正常血管系统内无血小板聚集作用，因此人体凝血酶仅在出血部位形成，而正常血管内不会存在凝血酶，也不会有纤维蛋白A、B单体。尖吻蝮蛇凝血酶是一种安全有效的新型止血药[15]，不会引起正常血管内血栓，可以体内给药用于出血和出血性疾病的预防和治疗。

4.2 抗血栓作用

尖吻蝮蛇毒类凝血酶清除纤维蛋白的前体，可以有效预防前者而控制血栓的发展，并增强纤溶作用。体内实验证明，尖吻蝮蛇毒类凝血酶能明显延长CT、APTr、PT、TT，降低纤维蛋白原含量[16]，具有很好的抗凝和溶栓的效应[17]。1995年，李志忠等[12]从尖吻蝮蛇毒分离提纯出单一成分，从而摆脱了之前该类凝血酶体内应用的出血毒副反应，使得尖吻蝮蛇毒在抗凝方面具有很好的开发前景。

5 尖吻蝮蛇凝血酶研究的展望

随着现代生物技术手段的快速发展，蛇毒类凝血酶的研究已经由蛋白质水平向分子水平转变。尖吻蝮蛇凝血酶在未来的研究中仍需攻克各种难关，然而研究主要问题又将向以下两个方面集中：①有关天然蛇毒的来源问题，很多蛇种都是国家保护品种，尖吻蝮蛇作为自然生物虽然在很多地区均存在，无止境的捕杀利用终有使其灭迹的日子。因此，要充分利用基因工程的方法生产尖吻蝮蛇毒类凝血酶，这将使天然蛇毒资源和产品纯度的问题得到解决，并且要在以后的蛇毒研究中改进表达系统解决产物蛋白复性、后修饰及对宿主的毒性问题，这将对提高表达量和生物活性有重要意义[18-19]。②目前对于尖吻蝮蛇毒类凝血酶的结构研究主要集中在一级结构和二级结构的研究，对于高级结构的研究还很欠缺，对其高级结构进行解析将成为未来研究重点。迄今为止，已分别得到的蛇毒类凝血酶有 acuthrombin B、jaramcussin、bothrombin和另外两种蛇毒丝氨酸蛋白酶结晶[20]。笔者希望能以此为基础尽快获得尖吻蝮蛇毒类凝血酶的晶体，如果能得到该凝血酶纯品并结晶出来，将可以利用晶体学等手段研究生物大分子的结构，从而从分子生物学的角度阐明其活性中心构造和酶催化机制。

尖吻蝮蛇毒类凝血酶作为具有知识产权的国产新药，目前对于该凝血酶性质、功能、临床应用等正在深入的研究，可以预见尖吻蝮蛇毒类凝血酶将会填补国产类凝血酶的空白，为临床用药提供更多的选择，况且已有研究表明，该凝血酶总体的药效和毒性都优于血凝酶注射液，不失为血凝酶注射液的潜在取代品。

[1]张洪基,肖昌华,唐绍宗.尖吻蝮(agkistrodon acutus)蛇毒的分离及其生物活性的研究[J].动物学研究,1980,1(2):157-162.

[2]杨填,许建衡,谢舜峰.尖吻蝮蛇凝血酶对胸部手术切口止血有效性及凝血安全性的临床研究[J].汕头大学医学院学报,2007,20(2):97-99.

[3]韦军民,朱明炜,张忠涛.尖吻蝮蛇血凝酶对腹部手术切口止血作用的有效性和安全性[J].中国新药杂志,2006,16(14):1126-1129.

[4]张艳宇,马平,陆一鸣.尖吻蝮蛇类凝血酶基因的克隆及生物信息学分析[J].中国实验血液学杂志,2005,13(4):542-547.

[5]唐松山,唐治华,李红枝.尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序[J].广东药学院学报,2009,25(4):392-396.

[6]翟宁,陈正杰,冯军.尖吻蝮蛇毒中一种新类凝血酶的分离纯化[J].中国医药工业杂志,2005,36(10):601-603.

[7] 郑颖,沈居仁,张富强.尖吻蝮蛇血凝酶N末端序列测定及其止血活性分析[J].中国药科大学学报,2008,39(4):365-367.

[8]Oyama E,Takahashi H.Purification and characterization of a thrombinlike enzyme,from the venom of Trimeresurus elegans(sakishima habu)[J].Toxicon,2000,38(8):1087-l100．

[9]Salazar AM,Rodriguez AA,Giron ME,et a1.A comparative an alys is of the clotting and frbrinolytic activities of the snake venom(bothropsatrox)from diferent geographical areas in venezuela [J].Thromb Res,2007,(120):95-104.

[10]吕慧敏,李长龄,董金婵.尖吻蝮蛇凝血酶的止血作用及其作用机制的研究[J].中国实验血液学杂志,2008,16(4):883-885.

[11]周素芳,钟满森,余清声.尖吻蝮蛇毒类凝血酶促凝作用的研究[J].蛇志,1997,9(4):1-5.

[12]李志忠,沈居仁,史兰汀.尖吻蝮蛇毒中类凝血酶(TLE)单一成份含量及体内去纤效应(摘要)[J].医学信息,1996,9(3):4.

[13]魏京娜,王晴川,刘广芬.尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶在兔体内的药物动力学[J].中国药理学与毒理学杂志,1990,84(3):213-215.

[14]唐松山,滕达,王晓华.一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶对血液活性的研究[J].徐州医学院学报,2005,25(4):308-312.

[15]王睿,方翼,裴斐,等.单剂静注尖吻蝮蛇凝血酶在中国健康志愿者的药代动力学[J].中国临床药理学杂志,2006,22(5):422-425.

[16]雷丹青,蒙怡,刘绵林.尖吻蝮蛇蛇毒抗凝、纤溶组分的分离及对凝血系统的影响[J].中成药,2006,28(4):545-547.

[17]黎肇炎,杨斌,唐双意,等.尖吻蝮蛇毒无出血活性纤溶酶对动物血栓的溶栓作用[J].中国药理学通报,2003,19(7):830-832.

[18]Francis S,M arklan.Snake venoms and the hemostatic system[J].Toxicon,1998,36(12):l1749-1800．

[19]杜道林,昊文芳,吕国安.蛇毒类凝血酶的基因工程研究进展[J].蛇志,2001,13(3):54-60.

[20]林奕心,余晓东,和七一.蛇毒类凝血酶研究进展[J].重庆师范大学学报:自然科学版,2009,26(2):27-33.