卵黄抗体在防治仔猪腹泻上的应用

崔桂清,李火举

(1.廊坊市动物疫病预防控制中心,河北 廊坊 065000;2.北京海思科瑞科技有限公司,北京 大兴 100176)

卵黄抗体(IgY)是蛋鸡受特定抗原刺激后体内会产生特异性并被转移和贮存在卵黄中的免疫球蛋白[1]。卵黄抗体的研究始于19世纪末至20世纪初,1889年,Klemperer发现了卵黄中富含抗体;1934年,Jukes的试验证明母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中,从而为雏鸡提供被动免疫保护。Patterson等(1962)试验证实:相对别的血浆蛋白,IgG被选择性地转运到卵泡中。1969年,Leslie和Clem将这种抗体命名为 IgY。Roth等(1981)和Locken等(1983)提出并证实IgY转运到卵泡的过程是受体依赖性的,认为卵巢的IgY受体使得血液中所有的IgY亚群被选择性转运到卵泡中。存在于禽卵黄中的免疫球蛋白主要是 IgY、IgM、IgA和IgD含量极少。

1 卵黄抗体(IgY)

1.1 IgY抗体结构 IgY大分子的结构与哺乳动物免疫球蛋白类似。Warr等(1995)通过分子结构分析认为IgY是哺乳动物体内IgG和IgM的进化前体。IgY 中Cυ 3和Cυ 4区与哺乳动物IgG 的Cγ 2和Cγ 3具有同源性;Cυ 2是 IgY的枢纽区,而它在IgY中没有得到充分进化。IgY中这种不发达的枢纽区造成了Fab部分的低活性,而这将可能是IgG与IgY某些差异的原因。与IgG一样,IgY的Fc片段是绝大部分生物受动器功能的作用部位。IgYFc部分包括2条碳氢链,而IgG只有1条。IgG在重链上含有3个功能域而IgY的重链含有4个功能域,而且IgY缺少铰链区。

1.2 IgY进入卵黄的机制 禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫,分别受胸腺和腔上囊的控制。当机体受到外来抗原刺激后,腔上囊内的B细胞分化成为浆细胞,分泌特异性抗体进入血液循环,当血液流经卵巢时,特异性抗体(主要是IgY)在卵细胞中逐渐蓄积。IgY通过受体调节作用,它只允许母源血液中存在的IgY选择性地向卵黄转移,转运量与其在血清中的浓度相关,该转运对不同IgY的次级成分没有差异性。当卵细胞分泌进入输卵管时,流经输卵管的血液中含有的特异性抗体(主要是IgA和IgM)进入卵清中,形成卵清抗体。Losc.H(1986)证实只有少量的IgA和IgM经输卵管从血细胞转运到鸡蛋白部分。

卵黄抗体作为一种新型绿色添加剂有其自身的优势:(1)卵黄抗体产量高,Anders(1993)推算认为一只蛋鸡每周的抗体产量相当于9～10只小白兔的抗体产量。(2)鸡蛋的生产成本较低,收集和提纯方便,大规模提取抗体的技术已经成熟。(3)产生有效免疫反应所需抗原量小。(4)IgY的化学性质稳定,具有一定的耐热、耐酸、耐碱及耐高渗性能,对胃蛋白酶具有良好的抵抗能力[2]。(5)由于种系发生距离相差很大,禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应。(6)不激活哺乳动物的补体系统,不与类风湿因子或Fc受体相结合,避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳性结果。(7)对肠道正常菌群无副作用,也不存在抗药性和药物残留问题。IgY本身是一种优质的蛋白源,有促生长作用。

2 卵黄抗体在猪生产中的应用

2.1 卵黄抗体在防治仔猪腹泻上的应用

2.1.1 仔猪大肠杆菌性腹泻机制 仔猪大肠杆菌腹泻是产肠毒素大肠杆菌(ETEC)引起新生和断奶仔猪腹泻的主要致病菌之一[3]。大肠肝菌致病因子包括:粘附素(adhension)、肠毒素(enterotoxins)、水肿病毒素(edemadisease principle,EDP)、内毒素(endotoxin)、溶血素(haemolysin)以及最近发现的EatA。其中ETEC引起仔猪腹泻的主要致病原是具有宿主特异性的粘附素和肠毒素[4]。ET EC粘附素实质上是一种菌毛蛋白又称为定居因子(CFAS)。Conway(1990,1991)认为与小肠黏膜上的受体结合是ETEC致病过程中的重要环节。仔猪的肠道黏膜上皮细胞表面具有多种能与 ETEC特异性粘附素结合的受体。ET EC宿主特异性菌毛粘附素有 20多种,引起仔猪腹泻的主要是K88(F4)、K99(F5)、987P(F5)、F41等[5]。ETEC 菌毛抗原能够识别特定受体并与之结合使菌体能够抵抗肠道蠕动产生的冲刷作用从而定植下来,大量增殖并产生肠毒素(耐热肠毒素、不耐热肠毒素、志贺毒素2e、肠管凝集耐热肠毒素)。耐热肠毒素(ST)与神经节苷脂(GM1)结合激活肠黏膜细胞表面的鸟苷环化酶(GC),使胞内cGMP含量增多从而导致腹泻;不耐热肠毒素(LT)与GM1结合后激活肠上皮细胞的腺苷酸环化酶,使细胞中cAMP水平升高,进而导致肠黏膜细胞对水和Na+、Cl-、HCO-3等过度分泌至肠腔引起腹泻。

2.1.2 IgY抑制大肠杆菌菌毛粘附素与小肠黏膜受体结合的作用机制 IgY抑制大肠杆菌菌毛粘附素与小肠黏膜受体结合的作用机制可包括以下几个方面:(1)特定病原菌卵黄抗体能直接粘附于病原菌的细胞壁上,改变病原细胞的完整性,直接抑制病原菌的生长。(2)卵黄抗体可粘附于细菌的菌毛上,使之不能粘附于肠道黏膜上皮细胞。(3)一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下,降解为可结合片段,这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分,这些小肽很容易被肠道吸收,进入血液后能与特定的病原菌粘附因子结合,使病原菌不能粘附易感细胞而失去致病性,而 IgY的稳定区(Fc部分)留在肠内。Jin(1998)用抗菌毛卵黄抗体处理后的大肠杆菌在体外与小肠上皮细胞的进行吸附试验,结果表明大肠杆菌在小肠黏液的吸附受到明显的抑制。但试验表明随着E.coli浓度的提高,抑制效果明显降低,说明lgY作用的发挥具有量依赖性。

Yokoyama H(1992)将提纯的 ETEC的K88、K99、987P制成单价菌毛蛋白苗,免疫蛋鸡获得卵黄抗体粉末,ELISA 检测结果表明,抗 K88、K99、987P的卵黄抗体能够特异性地与相应的菌毛抗原作用[6]。用卵黄抗体对不同ETEC菌株攻毒的新生仔猪进行口服治疗,治疗组仔猪全部存活,而对照组仔猪死亡率超过80%[7]。高云英(2003)用ET EC的K88、K99、987P标准菌株和地方分离菌株制成多价菌体卵黄抗体经预防、攻毒试验及临床治疗效果观察,对新生仔猪免疫保护率可达90%以上,3日龄仔猪攻毒保护率可达98%以上,3～11日龄仔猪临床治愈率可达95%以上。

2.1.3 影响卵黄抗体防治仔猪腹泻效果的因素(1)菌体与菌毛抗原。以菌体为抗原制备菌体疫苗,制作虽然方便但免疫效果不如菌毛抗原制备的菌毛蛋白苗效价高(肖驰等1998),试验还显示卵黄抗体对仔猪黄痢的治愈率高于庆大霉素、土霉素和痢特灵[8-9]。(2)卵黄抗体的剂量和 ETEC的浓度。小肠内所含抗体须达到一定剂量才能阻止E.coli粘附到小肠黏膜上皮细胞的受体上。(3)采用卵黄抗体进行治疗应具有连续性,例如:每只仔猪每天饲喂1.5 g的卵黄抗体能有效防治1010CFU/mL ET EC引起的腹泻,在饲粮中添加0.2%卵黄抗体可预防商业性猪场中仔猪腹泻。

2.1.4 卵黄抗体在猪肠道内的变化规律 对于新生仔猪,卵黄抗体能在肠道内能被有效吸收并被主动转运至循环系统,其吸收通道大约在出生后36 h关闭。卵黄抗体在血清中的半衰期大约只有1.85 d。抗体在0,3,6,21日龄的24 h内都保持一定滴度,表现出卵黄抗体对胃酸和消化酶有良好的耐受性(Yokoyama H,1992)[6]。随着仔猪日龄的增加,其消化系统逐步发育完善,使得胃酸pH降低和消化酶活性提高,卵黄抗体(IgY)分子在这种环境下结构易被破坏而失去活性。结合许多饲养试验结果,卵黄抗体在4～5周龄仔猪肠道内仍能保持相当高的稳定性。因此,对于3～4周龄的断奶仔猪,用卵黄抗体防治细菌感染能保证其有效性。

2.2 卵黄抗体在猪防治其他疾病中的应用 刘湘新等(2004)采用猪链球菌活疫苗(ST17I株)免疫鸡制作卵黄抗体,免疫效价达到1∶1024,血凝抑制效价为1∶1600,并且高免蛋可在7～30 d维持。

3 问题与展望

卵黄抗体有其自身优势,但IgY在生产中也存在不容忽视的问题:经蛋垂直传播疫病的病原,可能存在于卵黄抗体中,如减蛋综合征、禽白血病、禽沙门菌病、鸡慢性呼吸道病等;蛋黄中含有大量分子量很大的卵黄磷蛋白及脂肪等物质,注入肌肉难以吸收而造成局部肿胀、坏死和过敏反应[10]。卵黄抗体粉是高蛋白物质,营养丰富,生产过程中极易污染细菌;随着仔猪消化系统逐步发育完善,使得胃酸pH降低和消化酶活性提高,IgY的分子结构易被破坏而部分失去活性。因此,需要进一步研制开发IgY的有效保护剂;生产卵黄抗体还没有规范的操作规程,也没有用于监测的质量标准。应尽快建立、完善和统一IgY的产品质量标准,以保证其产品质量的可靠性。应用抗生素容易导致药物残留和耐药性;用疫苗免疫母猪,母源抗体含量高但持续时间短;口服高免动物血清成本较高[11]。IgY作为一种新型的绿色添加剂,具有安全、经济、高效的特点,符合人们对于安全绿色食品生产的要求,因此在生物制品的开发和疾病的防治方面具有广阔的前景。多价卵黄抗体微生态制剂是多价卵黄抗体与益生菌两种活性物质有机组合的固体制剂,能充分发挥卵黄抗体的特异性免疫功能与益生菌的非特异性免疫及相应生理促进功能,达到预防和治疗感染性疾病的作用,而且具有无污染、无抗药性、无残留、药效持续时间长等特点,可有效替代抗生素,在畜牧保健领域有广阔的应用前景。

[1]王炯,龚春梅.鸡卵黄抗体理化特性的研究[J].中国生物制品学杂志,1997,10(3):140-143.

[2]杨正时.动物病原性大肠杆菌与大肠杆菌病[J].中国兽医科技,1987,17(6):25-29.

[3]肖驰,周淑兰.大肠埃希氏杆菌卵黄抗体的研制与应用[J].中国兽医科技,1998,28(4):21-23.

[4]龙中儿,钟青萍,刘活林,等.卵黄免疫球蛋白的稳定性研究[J].中国生物制品学杂志,1997,10(4):218-220.

[5]王红宁.规模化猪场仔猪黄、白痢的防治研究[J].中国预防兽医学报,1999,21(4):264-267.

[6]Yokoyama H,Peralta R C,Diai R,et al.Passive protective effect of chicken egg-yolk immunoglobulins against experimental enterotoxigenic Escherichia coli infection in neonatal pigs[J].Infect Immun,1992,60(3):998-1007.

[7]胡子信.鸡抗猪大肠杆菌卵黄抗体的研制[J].中国畜禽传染病,1994,2:26-27.

[8]周壁君.仔猪腹泻源大肠杆菌贵州株K88菌毛研究[J].中国预防兽医学报,2000,22(4):291-296.

[9]范节才.大肠杆菌987P抗原的提纯及部分特性鉴定[J].中国畜禽传染病,1987,35(4):53-56.

[10]徐香.肠毒素性大肠杆菌菌毛的快速检测方法[J].中国人兽共患病杂志,1987,3(3):40-42.

[11]邝明慧,李淑霞,呼尔西旦.产肠毒素大肠杆菌987P抗原的纯化[J].中国兽医杂志,1987,13(2):49-50.