细菌整合子-基因盒系统

王 宏,薛 原,2,张秀英

(1.东北农业大学动物医学学院,黑龙江 哈尔滨 150030;2.东北林业大学野生动物资源学院,黑龙江 哈尔滨 150040)

随着抗生素在临床上的广泛应用,细菌在抗生素的选择压力下耐药菌株不断产生,耐药性问题日益严重,其中整合子是加快临床耐药菌株产生的重要原因。它是细菌基因组中可移动的遗传物质,通过位点特异性重组捕获外源基因盒(gene cassettes)并使之表达,同时整合子可位于质粒、染色体或自身作为转座子的一个组成部分而参与转移,使细菌的耐药性在病原菌中广泛传播。

1 整合子

1.1 整合子的结构 自整合子-基因盒系统正式提出以来,该系统目前对耐药机制研究起了很大的作用,并已取得了较大的进展[1]。

整合子基本结构包括 5′保守末端(5′-CS)、3′保守末端(3′-CS)和两者之间的可变区三部分。5′-CS是整合子的基本结构,包括编码整合酶的基因(Int I)、整合子重组位点att I和整合子可变区启动子(Pant)。Int I属于酪氨酸整合酶家族,催化基因盒在整合子重位点att I和基因盒重组位点attC之间的整合和剪切[2]。有的整合子在Pant下游还有启动子P2。可变区可插入编码一些功能的基因为抗生素耐药基因,被称为基因盒。有的整合子在5′-CS和3′-CS之间没有基因盒插入,插入的基因盒不能自身进行表达,必须借助于5′端的2个启动子。整合子的3′端的结构因不同菌株和整合子类型不同而异,有的甚至没有3′端结构。

1.2 整合子的分类 整合酶基因(Int I)可以捕捉外来游离基因盒将其整合在整合子上,同时也可以将自身的基因盒切除,形成自由环状片段[3]。目前根据整合酶的序列不同,至少已发现有10种整合子,其中6类整合子含有抗生素耐药基因盒[4-5],但公开报道研究最多的整合子主要有4种。

Ⅰ类整合子最常见,其5′-CS末端区有编码整合酶的基因Int I及启动子Pant,部分还会有启动子P 2[6],3′-CS末端包括3个开放阅读框(ORF),即磺胺耐药基因(SulⅠ),季铵盐化合物及溴化乙淀耐药基因(qacE△1)及功能不明的ORF-5[7]。两个片段之间区域可插入有编码功能的基因盒。大多数Ⅰ类整合子的 5′-CS相似 3′-CS存在差异,通常存在于Tn21及与Tn21类似的转座子上。此整合子阳性株的耐药率明显高于整合子阴性株[8]。

Ⅱ类整合子存在于 Tn7或它的衍生物上,与IntI1有40%的同源性,其整合酶基因IntI2是缺陷的整合酶基因,不能催化基因盒的整合与剪切。目前仅发现核苷转移酶基因aadA la、甲氧苄啶耐药基因dfr及链霉素耐药基因sat位于该类整合子上。

Ⅲ类在耐碳青霉烯类抗生素的粘质沙雷菌的质粒上发现的,其整合酶IntI3与IntI1有60.9%的同源性。Ⅲ类整合子携带编码β-内酰胺酶的基因盒,且目前只发现耐碳青霉烯类抗生素基因位于该整合子,可能是转座子的一部分,与Tn402密切相关。

Ⅳ类整合子是在霍乱弧菌基因组中首次发现,其整合酶IntI4与前三类整合子的整合酶有45%～50%的同源性。此类整合子的可变区可带有上百个基因盒,故又称为超级整合子(SI)。SI基因盒中的基因除了与细菌耐药有关外,还与细菌的代谢和毒力有关。此外在梅氏弧菌、费氏弧菌、拟态弧菌等细菌的染色体基因组中也发现了超级整合子。

Ⅴ类整合子见于最小弧菌。Ⅵ类整合子见于麦氏弧菌,含有26个独立基因盒[9]。

2 基因盒

2.1 基因盒的结构与种类

2.1.1 基因盒的结构 基因盒是一种可移动性基因元件,可以环状的形式独立存在,也可整合入整合子中而成为整合子结构的一部分。基因盒具有共同的结构,由单一基因和一个位于其下游的整合位点attC(常用59 be表示)组成。attC位点是一个不完全的反向重复序列,并含有一个可被整合酶识别的特异性整合位点。59 be的长度为57～141 bp,其最高度保守的特征是两个7 bp的核心位点:一是核心位点G TT RRRY(R:嘌呤,Y:嘧啶),位于 59 be的3′端;二是与之相对称的反向核心位点RYYYAAC,位于 59 be的 5′端。在整合过程中,重组交换发生在59 be重组位点的3′端7 bp核心位点保守的Ga37中,59 be的特殊结构基因盒的插入和表达提供了重要的结构基础。

2.1.2 基因盒的种类 目前发现已有80多种基因盒,新的基因盒还在被不断发现。基因盒含有β-内酰胺类、氨基糖苷类、头孢类、甲氧苄啶、氯霉素、磺胺类等抗生素耐药基因,常见的包括以下几类:(1)aad、aac基因家族 主要表现对氨基糖苷抗生素的耐药。aad基因编码氨基糖苷腺苷酰基转移酶,分为A、B两类。目前发现aadA有aadA1-aadA7不同的成员,如aad A5编码对链霉素、壮观霉素的耐药性,aadB编码对氨基糖苷类的庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素的耐药性;aac基因编码氨基糖苷乙酰转移酶 ,目前有 aac(1)、aac(2′)、aac(3)、aac(6′)。其中aac(3)又可分为aac(3)-Ia、aac(3)-Ib、aac(3)-Ic。(2)dfr基因家族 编码二氢叶酸还原酶(dfr),对甲氧苄啶耐药,据编码的酶类型不同分为A、B两类,dfrA编码的二氢叶酸还原酶有157～187个残基,dfrB编码的酶长度大约只有78个残基[10]。(3)β-内酰胺酶和超广谱β-内酰胺酶基因 耐氨苄西林基因盒blaPSE-1,头孢菌素耐药基因盒balCMY-2,及 blaVEB-1、blaGES-2、blaCTX-M22 等,还有一种新的OXA-类β-内酰胺酶基因盒,特指blaOXA-129基因(由命名中主在http://w w w.lahey.org/S tudies/获得)[11],越来越多的此类基因盒被发现。(4)Ⅱ类内含子 它被发现能够插入到aadA1基因盒59 be的整合酶结合的主要区域1L,Ⅱ类内含子[11]的插入方向与基因盒插入的方向相反,它是一个有424个氨基酸蛋白质的开放读码框(ORFII),其序列与逆转录酶有关。(5)其他基因 大多有甲氨嘧啶类、氯霉素、链霉素、红霉素、氨基糖苷酰苷、乙酰基转移酶耐药基因,它们抗性基因分别是 sut1、qucE、cmlA 和 catB3、blap1 、sat 、ere 和 orf5等[12-13]。此外还包括chrA 、orfF,orf1、qacE_1。

2.2 基因盒的表达 基因盒只有在整合子中才能转录,现已知的绝大多数基因盒不含启动子,转录需从整合子的启动子开始。基因盒的表达水平不仅依赖于启动子的强弱,而且与离启动子的距离有关(距离启动子越近的基因盒表达率越高),在质粒上的整合子还与质粒的拷贝数有关[4]。

基因盒总是以 5′-3′的方向整合入整合子,使其可以在上游启动子Pant的作用下得以表达。抗生素耐药的精确度取决于上游基因盒的数目和性质。被捕获的基因盒5′端与整合酶的att I结合,3′端59 be片段与attC发生特异性整合。同时整合酶也可介导attC和att I以外的第二位点的整合,称为非特异性整合。虽然整合频率较低,但因其周围只有一个重组位点而不能被切除,其在细菌基因组、质粒、转座子进化中起重要作用。整合酶介导的基因盒的剪切主要发生在两个attC位点之间。59 be常可形成一种茎环结构,可抑制下游基因盒的表达。但下游表达较弱或不表达的基因盒在抗生素的压力下,有可能借助整合酶介导的基因重组,插入到强启动子或靠近Pant的位置,由低水平表达转为高效表达,耐药水平随之上升。

2.3 基因盒的移动 一个整合子可以捕获一个或多个基因盒,且同一个基因盒可以整合到不同的整合子上,从而导致基因盒的移动。整合子介导的基因盒的移动被称作盒捕捉,其发生过程有两种机制。第1种:整合酶从整合子(供体)中切除的一个基因盒,形成一个共价闭环,然后它插入到另一整合子(受体)的attC位点;第2种:整合酶重组的供体和受体质粒,这些质粒都是由att I或者attC位点所形成的单一的共联体质粒,它们可由整合酶分成两个单独的质粒,一个质粒(受体)通过盒捕捉获得基因盒,另一质粒则失去。这两种机制都是保守过程,它们所形成的最后的盒捕捉产物通过序列测定是没有区别的[3]。

3 整合子-基因盒的检测

目前整合子的检测主要运用分子生物学的方法。由于第1、2、3类整合子与细菌耐药密切相关,临床菌株中整合子的检测主要针对此三类整合子。

3.1 PCR检测法 目前应用最广泛的检测方法,根据Ⅰ类整合子两端保守序列及耐药基因序列设计引物,通过PCR扩增检测整合子和基因盒,对产物进行序列分析。也可用荧光定量PCR进行整合酶基因的快速检测。

3.2 核酸杂交法 根据Ⅰ类整合子两端保守序列设计探针,对质粒和染色体DNA进行核酸杂交检测整合子,此外可利用基因盒探针检测其中基因盒的种类。

3.3 其他检测方法 Hardw ickb S A等[14]建立了一种SYBR实时定量PCR来检测自然环境中细菌的整合子,还可以用基因芯片技术对整合子及基因盒进行检测和分析。

4 整合子-基因盒系统与细菌耐药性关系

细菌的耐药性甚至是多重耐药性开始大量出现,致使抗生素的疗效逐渐下降,给临床治疗带来了极大的困难。近年来国内外对整合子的研究呈积极状态,Centron D等[15]研究了多重耐药的粘质沙雷菌,发现在同一60 kb的质粒上存在3个整合子。第2个整合子上发现了新的氨基苷类耐药基因ant(3′)-Ii-aac(6′)-Ⅱd,兼具 ant(3′)-I和 aac(6′)-Ⅱ的功能。随后又出现一个不完整的 blaOXA-10基因,这是一种新的基因融合形式。第3个整合子上有3个已知的基因盒,它们都存在于Ⅱ类内含子上,此种复杂的结构赋予该菌明显的多重耐药性。Grape M等[16]报道105株尿液标本中分离的革兰阴性细菌中59株(56.2%)整合子阳性,整合子阳性菌株平均对4.2种药物耐药,而整合子阴性菌株平均仅对1.9种药物耐药。Shi L等[17]报道46株分离自临床标本的革兰阳性细菌中第一类整合子的阳性率为100%,表明第一类整合子也广泛分布于革兰阳性细菌中。有研究分析过20株鲍曼不动杆菌,其中有1株带有Ⅰ类和Ⅱ类的杂交整合子,说明了整合子新的进化方向。在抗生素选择性压力下,整合子会不断进化,产生新的耐药形式;整合子的存在方式和传播方式的灵活性为细菌多重耐药性传播加速性提供了便利条件。

5 结语

研究整合子-基因盒系统介导和传播细菌耐药性及对细菌基因组的进化的影响,为阐明细菌耐药性的分子机制提供了新思路。目前研究发现破坏耐药基因就可使细菌恢复对抗菌药物的敏感性。随着整合子的深入研究,许多方面还有待于进一步探讨:(1)整合子中基因盒的起源。(2)各类整合子出现频率不同的原因。(3)快速、简便、低廉的整合子检测方法等。

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