影响山绵羊胚胎移植手术粘连的因素分析

权富生,黄 欣,张 涌

(西北农林科技大学动物医学院农业部家畜生殖生理与胚胎工程重点开放实验室,陕西杨凌712100)

山、绵羊由于个体相对较小,非手术法收集胚胎和移植效率很低、难度大,相对而言,手术法回收胚胎和移植胚胎比较容易进行,回收效率也高[1]。所以手术法为目前山、绵羊胚胎回收和移植的主要方法。但是手术法最大的问题就是术后母羊的卵巢、输卵管、子宫以及肠系膜之间等易发生粘连,影响供、受体母羊的重复利用和增加胚胎移植的成本。据研究,山、绵羊胚胎移植中,供体行施一次手术后总有2%～3%的个体发生手术粘连,如果重复手术,粘连率会急剧增加[2]。解决山、绵羊胚胎移植供体和受体手术粘连问题,对于提高供体和受体重复利用率和胚胎移植效率,促进胚胎移植技术的生产实用化推广和应用具有重要意义。

1 影响山、绵羊胚胎移植手术粘连的原因分析

影响山、绵羊胚胎移植供体和受体手术后粘连的因素较多。从胚胎移植供体开始处理到收集完胚胎及受体胚胎移植,影响手术粘连的因素概括起来有以下方面：

1.1 超排反应对粘连的影响 影响胚胎移植效率的主要因素是超排效果和移植妊娠率[3-4]。许多胚胎移植技术人员,往往喜欢选用较大剂量的激素进行超排,以追求获得较好的超排反应和收集更多的可利用胚胎,但是一次超排处理卵巢反应过于强烈,卵巢体积明显增大,卵巢表面黄体分布较多,卵巢从腹腔拉出时容易损伤出血,一旦发生出血,粘连发生就很难避免。在山、绵羊胚胎移植实践中,从防止粘连的角度考虑,尽量选用低剂量的促性腺激素进行超排。一般山羊供体每次超排平均排卵数在10～15枚,绵羊平均排卵数在7～10枚比较合适。据国内山、绵羊超排的资料分析,不同作者和不同单位之间,激素用量差别很大[5-8],合适剂量没有统一的参考标准。尽管山、绵羊超排对促卵泡素(FSH)表现出很大的耐受性,使用范围比较大。但从供体重复利用和防止过分超排反应来说,用低剂量FSH比较合理。

1.2 胚胎移植手术操作水平对粘连的影响 胚胎移植手术操作熟练、规范,能很快找到卵巢和子宫体,顺利牵引出腹腔,冲卵顺利,不发生卵巢、输卵管损伤以及黄体破裂等情况,一般手术后发生粘连的机会会大大降低。胚胎移植中防止组织出血和损伤是防止粘连的最好方法。当腹腔内腹膜受到机械损伤、局部缺血、异物等刺激后,腹膜发生炎症反应,炎症因子活化,纤维蛋白渗出。如果纤维蛋白溶解作用受到抑制,纤维蛋白沉积至纤维组织增生,粘连就形成[9]。所以手术中应细致操作,严格遵守手术操作规范,减少手术时间,防止组织创伤,保证组织良好血供,防止异物介入,使用无滑石粉的手套,术后反复冲洗,严密缝合组织,严格止血,避免组织结扎过多或缝合过密等[9]。在胚胎移植工作中培养和培训专门的技术人才,规范胚胎移植实施机构管理,严格训练,培养良好的操作习惯对于提高胚胎移植总体效率及防止供体粘连损伤具有重要作用。

1.3 胚胎回收方法对粘连的影响 从理论上说,非手术法回收胚胎时母畜生殖器官损伤最小,但是山、绵羊非手术法回收胚胎和移植胚胎技术方法还很不成熟,也无专门的商业化配套器械,所以手术法目前仍然为山、绵羊超排后胚胎回收的主要技术方法[1]。根据收集胚胎的时间和采卵部位分为输卵管法和子宫角法。从操作损伤来看,输卵管法因为要接触输卵管伞,容易引起伞部与卵巢粘连,另外输卵管法回收胚胎时,如果时间把握不好,在输卵管没有收集到胚胎或者收集到少量胚胎,与排卵数(黄体数)之间差异较大,必须在子宫角和宫管结合处收集胚胎,增加了输卵管及子宫角的损伤机会。采用子宫角回收胚胎,就只进行一次,而且随着冲卵设备和技术的改进,回收胚胎率与输卵管法基本接近。子宫角法基本不伤及输卵管伞部,损伤少,粘连机会就相对减少。子宫角法根据所用器械和回收胚胎方法的不同分为针回收法和三通管回收法。目前国外普遍采用三通管法,因为这是商业化开发的专门冲卵器械,回收率比较高,就是子宫损伤比较大,但是如果操作得当,子宫损伤处经缝合,不会留下后遗症,如果操作不当会造成子宫内翻或引起瘘管。在胚胎移植重复手术中笔者见过多例这样的母羊。国内近年来,通过自己的自主研究开发,已经研制出了比较配套的针回收技术[10-11]。回收针刻有螺纹状的出液口,胚胎回收率很高,一般胚胎回收率可达95%以上,与三通管回收率无差异。针回收法器械比较简单,也比较配套。主要由冲卵针和回收针组成,还有肠钳、阻血镊等。冲卵针由6～7号针头改制而成,回收针一般用12号不锈钢穿刺针改制而成,在回收胚胎时夹子宫体的肠钳和夹输卵管部阻血镊上套有医用乳胶管,对输卵管和子宫体的损伤很小。在操作过程中,肠钳夹的力量合适,子宫体和输卵管部不充血,不会引起粘连发生。笔者在山羊和绵羊胚胎移植中一直采用此方法,回收胚胎率高,粘连率低于三通管法。

采用腹腔内窥镜技术进行胚胎移植手术,因其具有切口小、损伤少、术后恢复快、减少腹腔粘连等优点[12-14]得到普遍应用。可以用于手术前供体排卵情况观察和受体黄体观察,也可以用于胚胎回收和移植手术过程中,不仅可以剔除无效超排供体和不可利用受体,减少不必要的手术,同时也可以减少手术过程创伤,减少供体和受体羊的粘连比例。但是腹腔内窥镜购置设备需要较多资金,操作也不容易掌握,需要反复实践,在生产推广应用中受到一定的限制。

1.4 重复超排处理和胚胎回收对粘连的影响 从国内外山、绵羊重复超排和重复回收胚胎研究可以看出,往往前两次手术供体数量较多,在第3次、第4到第5次,可用供体数明显减少。Bari F等研究了绵羊超排反应和胚胎回收率重复能力问题,从第1次超排到第4次超排,有效排卵母羊数分别为222只、73只,26只和7只,回收胚胎母羊分别为224只、74只、23只和7只[2]。国内王建国等报道了白绒山羊重复超排和手术,连续4年4次超排,有效供体数分别为91只、43只、7只和 2只[15]。这些超排母羊数和回收胚胎母羊数减少的主要原因是由于粘连问题,将不能用于冲胚的母羊进行了剔除。在胚胎移植实践中,重复超排次数越多,粘连羊的比例越高,导致最后可超排母羊数量很少。笔者在重复超排中也遇到类似情况,每次重复超排对于上次严重粘连供体予以淘汰,只处理认为可以重复回收胚胎的供体。因为输卵管、卵巢、子宫、肠系膜粘连羊,收集胚胎时往往要进行微手术分离,每次分离会造成更加严重的粘连,在以后超排中就不能使用。在生产中发现,如果重复超排时间间隔在一年以上,重复超排反应不会减弱,母羊排卵数也不会减少,而且母羊妊娠可以使已经发生粘连的子宫体与肠系膜之间的位置复位,有利于卵巢和子宫体等器官的恢复。但是常可以见到,由于粘连问题,引起回收胚胎中未受精卵的比例增加,甚至超排反应很好,由于粘连严重却不得不放弃冲卵。重复多次超排和手术,明显可以增加供体母羊卵巢、输卵管、子宫体之间及与腹腔的粘连比例。

1.5 术后输卵管、卵巢、子宫体及腹腔处理对粘连的影响 山、绵羊胚胎移植术后输卵管、卵巢、子宫及腹腔处理这是非常重要的一个环节,也是目前胚胎移植中防止腹腔粘连的主要关键技术问题。目前在山、绵羊胚胎移植技术方面进行预防粘连的方法主要是用生理盐水冲洗腹腔并灌注生理盐水,涂抹石蜡油[18]及用抗生素处理创口防止感染引起粘连。在山、绵羊胚胎移植技术中应该积极借鉴和吸收人医防止腹腔手术粘连的技术成果[16-17]。何刚等[19]应用几丁糖防治大鼠腹腔粘连,证实几丁糖能抑制Ⅰ型胶原基因的表达,减少Ⅰ型胶原的合成,从而减轻粘连的程度。杨伟明等进行试验表明,右旋糖酐具有预防术后肠粘连的作用[20]。笔者所在实验室将人医用丁壳质糖应用于山羊胚胎移植中,进行预防粘连的研究,表明可以大大减少山羊胚胎移植手术后粘连率及明显提高供体的重复利用率。

1.6 其他因素对粘连的影响 供、受体母羊手术前的饥饿空腹、术后母羊精心护理、严格消毒,防止腹腔内外感染等也是不可忽视的因素。

2 小结

在超数排卵处理过程中,使用较低剂量的、比较合理的FSH用量;注意手术的规范化操作,不断提高技术熟练水平;采用损伤较小的子宫角法收集胚胎和移植胚胎;使用有效的腹腔防粘连技术,包括使用防粘连剂;注意母羊手术前饥饿空腹;防止手术后腹腔内外的感染等。通过综合性预防措施和手段,可以有效避免山、绵羊胚胎移植术后的粘连发生及有效提高供体和受体母羊的利用率,提高胚胎移植效率。

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