化脓隐秘杆菌溶血素的研究进展

田 凯,王秋霞,郭文洁,朱竟赫,刘耀川,刘明春

(沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳110866)

化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)是 一种条件性致病菌,可在家畜间广泛传播,常导致多种动物如牛、羊、猪和人多种器官的化脓性感染,如肺炎、关节炎、心内膜炎、乳房炎、脓肿、骨髓炎及子宫炎等[1]。迄今为止,已发现的化脓隐秘杆菌毒力因子主要有溶血素(PLO)、神经氨酸酶(Nan)、胶原结合蛋白(Cbp A)及菌毛合成蛋白(Fim),其最主要的致病因子是细胞外毒素溶血素。现就化脓隐秘杆菌溶血素的研究现状作以综述,期望对化脓隐秘杆菌的致病机制及化脓隐秘杆菌病的防治等研究有所帮助。

1 溶血素的生物学特性

化脓隐秘杆菌溶血素(Pyolysin,PLO)是化脓隐秘杆菌一个主要的致病因子。PLO是由534个氨基酸组成的单链多肽,分子量为57.9 k Da。若p lo基因发生插入失活,将导致 PLO的溶血活性丧失。

PLO作为一种外毒素,能够溶解多种动物的红细胞、免疫细胞,可使化脓隐秘杆菌在血琼脂上出现特异的β-溶血,并能引起试验动物皮肤坏死以及动物死亡;PLO对牛、羊多形核白细胞、鼠类腹膜巨噬细胞及袋鼠肾细胞具有细胞毒效应。PLO具有氧化稳定性及胆固醇依赖性。对所有化脓隐秘杆菌分离株的检测发现,它们都能产生PLO。p lo基因为化脓隐秘杆菌的特异性基因,采用PCR技术快速扩增该基因可用于化脓隐秘杆菌的鉴定[2-3]。Billington等研究发现,重组PLO的未纯化特异性抗体能完全中和化脓隐秘杆菌的溶血活性,并能被动保护小鼠防御化脓隐秘杆菌,表明PLO既是毒力因子,又是宿主保护性抗原[4]。1999年,Jost等应用经甲醛灭活的重组体PLO对小鼠进行预防接种,发现其可保护小鼠免受腹膜内化脓隐秘杆菌的攻击[5];又于2003年发现了3种不具有溶血活性的类毒素即HIS-PLO.F(497)、HIS-PLO.Delta P(499)和HIS-PLO.A(522),均无需灭活且可用于小鼠的被动免疫,从而实现了对化脓隐秘杆菌病的免疫预防[6]。

2 溶血素基因的结构与功能

2.1 plo基因 1997年,Billington等从野生型化脓隐秘杆菌BBR1中克隆了 plo全基因,并测定其核苷酸序列[4]。研究发现,plo基因存在于2.7 kb基因岛上,其上游区是一个开放阅读框架or f 121,编码13.4 kDa蛋白质;p lo结构基因大小为1 605 bp,编码534个氨基酸,-10区序列为 TAAATT,-35区序列为 TTGAGA,核糖体结合位点为AGGAAGGC。其下游区为 fsty和f fh基因,它们与许多细菌的信号识别颗粒具有相似性。

研究发现,在许多原核生物特别是革兰阳性菌中,smc和f tsY基因位置是相邻近的。在化脓隐秘杆菌中,保守的smc和f tsY基因被包含or f 121和plo基因的基因岛分开。其基因岛的G+C含量为or f 121(51.5%)、p lo(54.5%),低于周围持家基因的平均G+C含量(62.59%),其中smc(62.3%)、f tsY(63.5%)、f f h(62.3%)[7]。此外,基因岛的Ala、Gln、Asn、Thr和 His密码子处于不稳定状态,其密码子使用频率低于周围基因。因此,推测毒力因子p lo基因可能是水平转移获得的,但其整合到细菌染色体的机制尚不清楚。p lo基因的获得将共生的化脓隐秘杆菌变成潜在致病菌,这与产单核细胞李斯特菌LIPI-1致病岛的获得相似。

2.2 PLO蛋白 化脓隐秘杆菌溶血素(PLO)属于胆固醇依赖性溶细胞素科(Family of cholesteroldependent cytolysin,CDC)毒素,通过在真核细胞膜形成孔结构来发挥细胞溶解效应。CDCs科成员都具有一个特异保守十一氨基酸多肽序列 ECTGLAWEWWR,可能与膜胆固醇相互作用有关。

PLO只有31%～41%的氨基酸与其他成员相似,并具有不同的十一氨基酸多肽序列EATGLAWDPWW。PLO的十一氨基酸多肽与人类特异性溶细胞素ILY相似,二者都缺乏与硫醇活化有关的半胱氨酸,且被丙氨酸取代,因此都不具有硫醇活性,并且其溶血活性对还原剂或硫醇阻断剂不敏感。PLO的定向诱变,用半胱氨酸替代丙氨酸,可使PLO具有氧不稳定性。PLO的十一氨基酸多肽序列中3个保守的色氨酸与其溶血活性及与胆固醇的结合有关,且差异序列与溶细胞活性相关。

此外,PLO蛋白N末端的两段氨基酸序列55～73和123～166也与PLO的活性有关,如单克隆抗体定向作用于此两区域可以阻断其溶血活性。这两个区域的定点突变可导致PLO的溶血活性显著降低,但单克隆抗体定向抑制PLO、十一氨基酸多肽序列不能阻断PLO的溶血活性。

3 溶血素的致病性

CDC在多数革兰阳性菌感染的发病机理中发挥重要作用。PLO已被证实是化脓隐秘杆菌感染的一个主要毒力决定因子。Jost等研究发现,p lo基因突变株的毒力显著减弱,且无溶血性,表明PLO是化脓隐秘杆菌产生的惟一溶血素[5]。化脓隐秘杆菌此种毒力的降低与肺炎链球菌和产气荚膜梭菌中CDC敲除的效应相似。

PLO对小鼠腹膜巨噬细胞、J774A.1巨噬细胞系及牛、羊白细胞具有毒性作用。此毒性能够保护细菌侵入生物体并且抵抗宿主免疫应答。因此p lo突变株在攻毒后48 h可迅速从感染小鼠体内清除。此外,化脓隐秘杆菌还表达一种突变型PLO,在十一氨基酸多肽序列中用色氨酸替代苯丙氨酸,其溶血活性＜0.3%,且毒力与p lo敲除突变株相似,说明PLO的细胞毒性与该菌的致病性关系密切。

除细胞毒性外,CDCs还能调节宿主细胞信号传导过程。PLO能正调节J774A.1巨噬细胞中肿瘤坏死因子α的表达,引起化脓隐秘杆菌感染的特异性炎症[1]。

4 溶血素的遗传与调控

化脓隐秘杆菌的plo基因和尚未明确功能的开放读码框or f 121位于2.7 kb的基因岛上,此段基因具保守性,并分开持家基因smc和 f tsY。p lo基因岛侧面没有明显的整合酶或重复序列,表明plo和or f 121可能是经水平转移获得的。其可能经同源重组插入到 smc和 f tsY的基因间区中。由于smc合 ftsY是细菌正常生长所需要的,二者之间的plo整合区域可能也为细菌生存提供了选择优势,且plo整合区域的缺失可能影响smc和 ftsY的表达。

化脓隐秘杆菌作为常在菌引起宿主感染疾病的复杂性与PLO作为致病因子的潜在多效性表明,PLO必须在体内被调节,而且这种调节可能在疾病起始和发展过程中起重要作用。Rudnick等研究化脓隐秘杆菌PLO的表达产物时,发现溶血活性高峰出现在静止期的初期,p lo特异mRNA在静止期初期也显著增多,表明PLO表达产物的调节与其转录水平有关[8]。

在p lo结构基因序列的上游区包含两个大肠杆菌σ70样启动子序列 P1、P2,三个同向重复序列DR1-DR3。位点定向诱变试验表明,P2是PLO在静止期中表达的主要启动子。DR1和DR2序列相同并位于P1上游区,DR3位于P1、P2之间。DR1、DR2突变可导致plo转录水平降低,仅有DR3存在时将抑制启动子P2的转录。当P2和DR3缺失时,p lo基因转录启动子的活性丧失。凝胶转移试验表明,化脓隐秘杆菌中存在一种反式作用因子能够与p lo启动子区域结合,其能够与只存在DR3和 P2或DR1和 DR2突变的启动子区域结合,不能与DR1-DR3全部缺失的启动子区域结合,说明DR3可能作为一种反式作用因子的结合位点,但不能排除DR1及DR2作为结合位点的可能性[8]。此外,or f 121突变株的溶血活性无变化,表明其不直接参与调节PLO的表达[7]。

5 小结

PLO是化脓隐秘杆菌的重要致病因子之一,其毒力可能受到宿主内因素、与其他细菌间协同作用以及各种毒力因子的差异性表达等多种因素影响[9]。目前对化脓隐秘杆菌毒力因子的研究尚不全面,仅对溶血素开展了一些研究,但对其作用机理、遗传调节及与其他毒力因子间的相互作用等方面的研究还不够明确。

随着人们对细菌耐药机制的深入研究,发现细菌的耐药性与毒力之间可能存在着一定关系。例如,对肺炎链球菌的研究发现,由于其青霉素结合蛋白(PBPs)发生变异导致产生青霉素耐药性,尽管PBPs并非毒力因子,但其发生变异可导致细菌毒力下降[10]。用甲硝唑诱导脆弱拟杆菌产生的耐药株其毒力有所增强[11]。但对猪链球菌的研究发现,经青霉素和红霉素诱导产生的耐药株毒力无显著变化[12]。由此可见,耐药菌的毒力与其耐药性间的关系可能因细菌种类而异。化脓隐秘杆菌毒力与耐药性的关系仍有待研究。

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