猪流感病毒血凝素研究进展

谢金文,沈 旭,沈志强

2.山东绿都生物科技有限公司

猪流感病毒血凝素研究进展

谢金文1,2,沈 旭2,沈志强1,2

2.山东绿都生物科技有限公司

Email:98xiejinwen@163.com

猪流行性感冒,简称猪流感(Swine influenza,SI),是猪的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。自美国1918年首次报道本病以来,欧、美、亚、非、澳等世界各大洲均有本病的发生和流行。SI能引起猪的高发病率(几乎100%)和低死亡率(病死率≤1%)。此病的发生可使患病猪生产性能下降,推迟上市;还可引起呼吸道细菌和病毒继发或混合感染,使疫情更为严重,造成猪只死亡。其病原为猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV),属于正黏病毒科A型流感病毒属,病毒粒子呈多形态,不过多数呈球形,直径约80-120nm。个别丝状体可长达数微米,常见于刚分离到的病毒颗粒,鸡胚或细胞内反复传代繁殖后变为球形。病毒有囊膜,由双层类脂膜、糖蛋白突起和基脂蛋白组成。囊膜表面有许多放射状排列的突起,即纤突和刺突。病毒颗粒内为核衣壳,呈螺旋状对称,直径为10nm。两端具有环状结构,存在于病毒的囊膜内。

1 SIV的基因组结构

SIV是单股负链 RNA病毒,基因组约为13.6kb,是由大小不等的8个独立片段组成。在所有的基因片段中,5′端的前13个核苷酸都相似,序列为 GGAACAAA-GAUGAppp5′,3′端的 12 个核苷酸也高度保守,其序列为HO-UCGU(C)UUUCGUCC-C〔1〕。8个基因片段编码10个基因产物,片段1和片断2最大,为2 341个核苷酸,分别编码不同长度的PB2和PB1聚合酶。片段3编码PA聚合酶,片段4、片段5和片段6分别编码血凝素(HA)、核衣壳蛋白(NP)和神经氨酸酶(NA),片段7有3个读码框,编码基脂蛋白(M1、M2和M3)。转录出的MlmRNA和M2mRNA的5′端序列相同,并且共用翻译起始密码,故 M1和 M2的前9个氨基酸是相同的。M3是一个连续的小mRNA,翻译能力有限,目前人们还没有分离到这一短肽,因此一些文献甚至不提M3。片断8最小,仅为890个核苷酸,该片段有2个开放阅读框,分别编码非结构蛋白 NS1 和 NS2〔1-3〕。

2 SIV HA的结构与功能

HA是病毒主要的表面糖蛋白,属于典型的I型糖蛋白,是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一,为杆球形蛋白分子,大小为4nm×14nm,在电镜下可形成星状聚合物。HA分子量为75kD,大约由562-566个氨基酸组成。HA含有4个结构域:信号肽、胞浆域、跨膜域和胞外域。HA在适宜条件下能凝集某些动物的红细胞。大多数情况下,血凝素均为热不稳定性,有报道称 60℃10min即可被灭活〔4〕。

IV基因组中HA和NA的变异频率最高,每个核苷酸在复制周期中,HA基因的变异频率可达2×10-3,是病毒发生抗原变异的主要原因。目前已经发现流感病毒的血凝素(HA)有16个亚型〔5〕,神经氨酸酶(NA)有9个亚型,而发现的SIV至少有H1N1、H1N2、H1N7 、H3N2、H2N3〔6〕、H3N1〔7〕、H3N6、H4N6、H5N1和 H9N2共 10种不同的亚型,但常见的只有 H1N1、H1N2、H3N2 等 ,其他血清型只有零星报道。

流感病毒的HA包括3个高度保守的半胱氨酸残基,靠近HA2亚单位羧基端棕榈化位点。功能性HA是由3个非共价结合的HA1和HA2肽链所组成,两者之间以一个精氨酸相连。HA1由328个氨基酸组成,HA的大部分抗原决定簇集中在HA1上,因此,HA1具有 HA的主要抗原性。SIV受体是位于细胞膜上的唾液酸糖脂和唾液酸糖蛋白,由位于流感病毒HA蛋白N端的受体结合部位HA1区与宿主细胞膜表面唾液酸受体末端的N-乙酰神经氨酸结合,使病毒附着于易感细胞表面,所以HA1对SIV侵入宿主细胞有重要意义。总的来说HA1具有与宿主细胞受体结合的特性。HA2由221个氨基酸组成,是参与和细胞融合的重要亚单位。HA水解成HA1和HA2,是感染的先决条件,水解后则去除连接肽或单一精氨酸。这在不同的宿主细胞是不同的。因此,HA对细胞蛋白酶的易感性和这些酶在宿主组织中的分布是病毒泛嗜性的决定因素。

SIV进入宿主细胞依赖于病毒囊膜与细胞膜的融合。HA在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用。利用HA抗体,可以分析和观察HA的结构及其与受体的结合。HA以三聚体的形式镶嵌在双层类脂膜上,每个HA单体可分成两部分,一部分由HA1构成的球形头部,含有受体位点和抗原决定簇;另一部分为柄,由HA1一部分和整个HA2组成,插入囊膜。SIV的受体是位于细胞膜上的唾液酸糖脂和唾液酸糖蛋白,而SIV的HA头部最外面是半乳糖,半乳糖和细胞膜上的受体相结合,从而使SIV感染细胞。SIV感染细胞后,SIV的HA2的N端融合序列(N-Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-A1a-Gly-Phe-Ile-Glu-Gly-Gly-)裸露出来并与细胞质膜发生融合,病毒基因组释放到细胞浆内,开始病毒复制〔1,8〕。

HA的膜融合作用除了需要蛋白酶的裂解外,还需要酸性环境。而这种融合作用是由于病毒HA在低pH诱导下变为具有融合活性的构象。罗汉松酸相关的复合物通过与A型流感病毒的中性pH构象相互作用,可以阻止低pH诱导HA变为融合性构象。胞浆域由10-11个氨基酸组成,其中5个氨基酸残基在A型流感病毒的所有亚型中都是保守的。乙酰化位点的减少可阻止HA1亚型感染性病毒的形成。去乙酰化作用不影响膜的融合和融合孔的形成,但可抑制合胞体的形成〔3,9-10〕。

SIV的HA受体结合部位呈口袋状,其位点相当的保守,如98位上的Tye,153位的 Trp,183位的His,190位的Glu,194位的 Lue;另外,这一位点周围的一些氨基酸也比较保守,如99位的Pro,97位的Lys,14位的Pro等。如果受体位点上的某个氨基酸发生变异不仅能引起抗原性变异,还能改变受体和病毒的结合能力〔1〕。有研究报道,HA序列的第226位氨基酸决定病毒的宿主特异性,当猪流感病毒第226位的氨基酸为蛋氨酸(M)时,病毒就具有感染禽的潜力。

HA基因在流感病毒识别靶细胞表面受体及穿膜过程中起重要作用,刺激机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染,还可以刺激机体产生细胞毒性淋巴细胞(CT L)反应。因此,对HA基因编码的蛋白的研究具有重要意义。

3 国内外的相关研究

陈艳等〔11-12〕以猪源 H1N1 SIV的HA基因为目的基因,构建了原核重组表达载体pET-HA,并对重组蛋白的表达条件进行了优化,使目的蛋白以包涵体的形式获得高水平的表达,同时对重组蛋白的抗原性进行了研究,以HA重组蛋白为抗原进行的间接ELISA,初步试验表明表达的重组HA蛋白具有良好的抗原反应性,为建立 H1亚型猪流感抗体间接ELISA诊断方法奠定了基础,并可作为已建立猪流感通用型抗体检测方法的一个补充,同时为HA基因表达蛋白监测血清中的抗体水平提供科学依据。

周庆丰等〔13〕用原核表达载体表达的SIV HA蛋白都是包涵体,表达量低,可溶性也很低,需要通过包涵体的变性复性来进行纯化,但这样很可能改变了表达蛋白的生物学活性。张祥斌等〔14〕选用pBCX高效可溶表达载体高效表达H1N1亚型SIV的HA蛋白,表达量占菌体总蛋白的29.5%,且大部分以可溶形式表达,这给目的蛋白纯化提供了方便。经Western-blot分析证实可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。用纯化的 HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选,成功筛选到2株针对HA蛋白抗原表位的单克隆抗体;ELISA结果表明,制备的SIV单克隆抗体ⅢF6A4C10与H1N1亚型SIV抗原具有特异的免疫反应性,为H1N1 SIV的鉴别诊断奠定了基础。

尹可等〔15〕将 H5亚型SIV HA1基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中进行了原核表达,HA1蛋白在表达系统中也主要以包涵体形式表达。表达的蛋白能被抗His单克隆抗体和抗H5亚型SIV阳性血清特异识别。并以镍螯合层析纯化表达蛋白,通过优化反应条件,建立了基于HA1重组蛋白的H5亚型SIV抗体间接ELISA(iHA1-ELISA)检测方法。该方法对H5亚型SIV抗体具有良好的特异性,与传统HI方法与传统HI方法具有较高的符合率。刘天强等〔16〕也进行了该方面的工作,与尹可等的实验结果稍稍不同的是在ELISA与HI方法的比较试验中,ELISA对SIV抗体阳性检出率高于传统HI方法。与其他血清学诊断方法相比,间接ELISA检测方法具有快速、试验要求不高、不需要无菌操作、操作简单、可短时间内检测大量样品等优点,适于普通实验室的SIV血清学诊断、海关检疫及大规模普查等。

李洪涛等〔17〕构建了H1亚型猪流感病毒 A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)HA基因表达质粒,基因免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,通过ELISA、HI试验筛选阳性克隆,应用ELISA、HI试验和Western blot试验测定mAb的反应性和特异性。结果共获得3株分泌抗H1亚型猪流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞株,并分别命名为8C4、8C6、9D6。mAb腹水ELISA 效价在1∶16 000～1∶256 000之间;HI效价为1∶512～1∶256 000;对A/Swine/Guangdong/LM/2004的中和效价分别为 :10-2.83、10-6.4、10-5.8。Westernblot分析结果显示,3株mAb只与H1亚型猪流感病毒 HA蛋白反应。

彭金美等〔18〕构建了含禽流感病毒HA、NP基因表位表达载体,对雏鸡免疫并攻毒,存活鸡HI抗体效价显著增高,流式细胞仪检测显示外周血CD4,CD8T细胞在免疫后都有不同程度的升高,对H5N1强毒攻击保护率达50%以上。

刘惠莉等〔19〕成功构建表达了含有SIV H1N1、H3N2亚型HA基因T、B抗原表位的模拟蛋白,构建的串联表位基因包含了来源于SIV H1N1、H3N2HA基因的T、B表位抗原,可同时诱导机体T、B淋巴细胞反应,具备理想疫苗的特性。且串联了通用T细胞表位,可诱导机体Th细胞免疫学反应,以充分调动全身免疫系统,最大限度发挥机体免疫效果。Jeon等〔20〕串联表达了 HA、NP蛋白的 B细胞的表位、辅助性T细胞表位,将此翻译肽段免疫小鼠后产生了体液免疫和辅助性T细胞反应,小鼠可抵抗致死性病毒的攻击,并迅速得以康复。陈义锋等〔21〕串联表达和动物流感HN、NA抗原表位,免疫小鼠,ELISA检测具有较好的免疫原性,为进一步探讨其作为表位疫苗的可行性奠定了基础。Stoloff等〔22〕通过合成多个表位,拟研制对各种血清亚型流感病毒均有效果的通用疫苗,为预防控制流感病毒大流行做好了技术储备。

所有这些为SIVHA抗原变异分析、猪流感诊断方法的建立以及猪流感病毒亚型的鉴定等奠定了一定的物质与技术基础。

〔1〕伍锐,金梅林,陈焕春,等.猪流感病毒研究进展〔J〕.动物医学进展,2004,25(1):25-28.

〔2〕殷震,刘景华.动物病毒学〔M〕.2版.北京:科学出版社,1997:704-730.

〔3〕吕翠,马小明,尹燕博,等.猪流感病毒研究进展〔J〕.动物医学进展,2008,29(11):60-63.

〔4〕王连想,毕英佐,曹永长.猪流感病毒广东株的分离鉴定及其特性〔J〕.中国兽医科技,2003,33(2):17-21.

〔5〕Fouchier R A,M unstert V,Wallensten A,et al.Characterizaiton of a novel influenza A virus hemagglutin in subtype(H16)obtained from black-headed gulls〔J〕.J Virol,2005,79:2814-2822.

〔6〕M a W,Vincent AL,Gramer M,et al.Identification of H2N3 influenza A viruses from swine in the United States〔 J〕 .Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(52):20949-20954.

〔7〕Ma W,Gramer M,Rossow K,et al.Isolation and genetic characterization of new reasso rtant H3N1 swine influenza virus from pig s in the midwestern United States〔J〕.J Virol,2006,80(10):5092-5096.

〔8〕Fields B N,Knipe D M,Howley P M,et a1.Fields virology〔M〕.Lippincott-Raven publishers,Phildelphia,1996:1353-1395.

〔9〕吴仁蔚,胡思顺,肖运才,等.检测禽流感病毒抗体的重组核蛋白间接ELISA方法的建立〔J〕.畜牧兽医学报,2006,37(10):1067-1072.

〔10〕Steinhauer D A.Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus〔J〕.Virology,2006,258(1):1-20.

〔11〕陈艳,乔传玲,丁选亚,等.猪流感病毒血凝素基因原核表达及其在间接ELISA中的初步应用〔J〕.畜牧与兽医,2008,40(11):10-13.

〔12〕陈艳,辛晓光,杨焕良,等.猪流感抗体间接 ELISA检测方法的建立〔J〕.中国预防兽医学报,2007,4:308-311.

〔13〕周庆丰,马静云,曹永长,等.H1亚型猪流感病毒广东株HA基因的原核表达〔J〕.华南农业大学学报:自然科学版,2007,28(1):105-108.

〔14〕张祥斌,谢青梅,马静云,等.H1N1亚型猪流感病毒HA基因的表达及单克隆抗体的制备〔J〕.中国兽医科学,2008,38(11):962-967.

〔15〕尹可,郭军庆,黄杰,等.H5亚型猪流感病毒 HA1重组蛋白的制备及间接ELISA检测方法的建立〔J〕.中国兽医科学,2008,38(9):762-766.

〔16〕刘天强,于海,张强,等.H3N2亚型猪流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立〔J〕.中国预防兽医学报,2008,30(10):795-823.

〔17〕李洪涛,刘明,刘春国,等.猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,2009,25(3):233-235.

〔18〕彭金美,童光志,王石峰,等.抗禽流感病毒多表位DNA疫苗的构建及其免疫效力研究〔J〕.生物工程学报,2003,9(19):623-627.

〔19〕刘惠莉,邢继兰,潘洁,等.猪流感病毒抗原表位基因表达载体构建与免疫原性分析〔J〕.生物工程学报,2008,24(4):690-694.

〔20〕Jeon SH,Ben-Yedidia T,Arnon R,et al.Intranasal immunization with synthetic recombinant vaccine containing multiple epitopes of influenza virus〔J〕.Vaccine,2002,20(21-22):2772-2780.

〔21〕陈义锋,金宁一,贾雷立,等.H3、H5、H7、H9 亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒构建〔J〕.免疫学杂志,2007,5(23):524-527.

〔22〕Stoloff GA,Caparros-Wanderley W.Synthetic multi-epitope peptides identified in silico induces protective immunity against multiple influenza serotypes〔J〕.Eur J Immunol,2007,37(9):2441-2449.

R373.1

A

1002-2694(2010)01-0088-03

1.山东省滨州畜牧兽医研究院 预防兽医学与动物生物技术重点实验室,滨州 256600;

2009-05-14;

2009-09-16