可饲(食)疫苗的研究现状

2010-02-11盛明巍赵玉军沈国顺

中国畜牧兽医文摘 2010年1期

盛明巍赵玉军沈国顺林颖

可饲(食)疫苗是通过将病原体内提取的免疫原基因与适当的能促使该基因活化的启动子一同植入植物的基因组中，使重组的外源蛋白在该植物的可食用部分稳定地表达和积累，从而使人类和动物的免疫接种通过摄食这些经过基因工程改造过的植物而实现——即以转基因植物为疫苗抗原的抗原传输载体，通过动物或人类的进食刺激肠粘膜系统产生免疫应答引发免疫反应。

1.可饲(食)疫苗的免疫机制

1.1 粘膜免疫应答的诱导

发生粘膜免疫的场所主要是一种特化扁平上皮细胞——微褶细胞(M细胞)，其功能是选择性粘附、摄取外来抗原物质并以小囊泡形式转运给上皮内淋巴细胞及生发中心，诱导粘膜免疫应答；微褶细胞在肠道派伊尔结(PP)中，与肠上皮细胞紧密排列在一起，呈圆顶状，细胞基底部向顶部(肠腔面)内陷呈袋状，其中含有丰富的淋巴细胞，顶部及周边胞质很薄，胞质中含有大量的吞饮小泡，微褶细胞的基底膜常是不连续的，允许淋巴细胞自由穿过。微褶细胞这些特殊结构大大缩短了含有抗原或病原微生物的吞饮小泡跨越微褶细胞的距离，这有利于抗原迅速进入上皮下淋巴组织。由于微褶细胞表面覆盖着各利：与其选择性粘附、内吞、转运外来抗原有关的糖蛋白，因此微褶细胞能够识别和区分普通食物抗原、正常菌群和病原性抗原，以保证人体免疫功能的正常运行，对粘膜疫苗的应用及药物的传送具有重要意义。由于微褶细胞不表达Ⅱ类组织相容性抗原分子，且细胞中降解蛋白质的溶酶体很少，因此微褶细胞可能不参与对抗原的加工和处理。在微褶细胞吞噬外来抗原物质并以小囊泡的形式转运至上皮下生发中心后，抗原被抗原呈递细胞(APC)加工、处理并呈递给B淋巴细胞，产生抗原特异性的淋巴母细胞，在生发中心增殖后通过血液迁移到远处的粘膜和腺体组织，并进一步分化、成熟为浆细胞，浆细胞分泌IgA形成双体，选择性地与上皮细胞聚合，通过封闭细菌和病毒对粘膜上皮细胞粘附来阻止病原微生物的侵入，同样还能中和细菌产生的毒素和灭活已经侵入上皮细胞的病毒。

1.2 粘膜免疫应答的效应

粘膜免疫效应部位主要包括上皮内淋巴细胞(IEL)和固有层淋巴细胞(LPL)。上皮内淋巴细胞是体内最大的淋巴细胞群，由于它们离肠腔很近，这就使得上皮内淋巴细胞成为粘膜免疫系统中首先与外源抗原接触的成分。上皮内淋巴细胞中有63%～80%为CD8+淋巴细胞，少数为CD4+淋巴细胞。研究结果表明，上皮内淋巴细胞有与细胞毒T淋巴细胞及自然杀伤细胞相似的胞内颗粒，并能分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ等淋巴因子，因此上皮内淋巴细胞具有细胞杀伤和防御肠道病原体入侵的作用。固有层淋巴细胞位于粘膜固有层，含丰富的T、B淋巴细胞，是IgA抗体产生的主要场所。浆细胞所分泌的大量IgA可通过分泌片的介导进入粘膜表面，中和抗原物质，清除外来抗原。

1.3 公共粘膜免疫系统

1964年，JamesC发现粘膜致敏、活化的淋巴细胞经导管、血液后又落户于粘膜效应部位发挥作用，而外周组织中活化的淋巴细胞就不会进入粘膜，粘膜细胞的这种归巢性使在粘膜某处致敏的淋巴细胞可以传播到粘膜组织的各个部位，称之为公共粘膜免疫系统，这是粘膜疫苗作用发挥的基础。因此，预防消化道、呼吸道和生殖泌尿道传染病可通过口服途径接种疫苗来产生有效的粘膜免疫反应。

此外，可饲(食)疫苗不但能够激发粘膜免疫反应，而且能够激发体液免疫反应，获得防御疾病的能力。

2.植物源性疫苗的优势

植物源性疫苗生物活性高，植物表达的许多外源蛋白的生理生化特性、生物学活性与天然蛋白相同；安全性高，可避免交叉感染；遗传的稳定性好；成本低，不需要复杂的医疗设备；无伦理性问题；比传统的免疫途径更有效；易于储存和分发，不需要冷藏设备，可以随时长期给药；不仅提供了疫苗，而且提供了营养；植物细胞壁有天然“生物胶囊”作用；在病原体和寄主相互作用的起始位点上能直接诱导强烈的粘膜免疫反应。利用转基因植物生产口服疫苗可以实现多价疫苗的价值，即吃一种植物可以同时抵抗多种疾病。

3.存在的问题及应对策略

3.1 提高外源基因表达水平，克服转基因沉默的应对策略分析

外源基因在转基因植物中表达受到抑制的现象称之为转基因沉默。基因沉默主要涉及外源基因之间或外源基因和植物内源基因之间的相互作用，最重要的原因是存在多拷贝的同源DNA序列，包括蛋白质编码区及启动子等调控序列。

3.1.1 启动子的选择

启动子能调控外源基因在植物愁因转化体内特定的时空秩序或在外源诱导因子的作用下呈现特异性表达，一方面可提高表达效果和表达水平，另一方面可节省生物能耗，减小外源基因对植物本身的影响。特异性启动子主要包括组织特异性启动子和诱导特异性启动子。

3.1.2 抗原在植物细胞器内的定位表达

通过连接适当的定位信号序列等方法修饰外源基因，使外源蛋白产生后能定向运输到细胞内的特定部位，蛋白特异性地表达并聚集于叶绿体、内质网等细胞器内，增强蛋白的表达功能，这些细胞器的质膜还可以起到保护所表达抗原的作用，从而增强转基因植物作为疫苗的效能。

3.1.3 位置效应的消除

在遗传转化中将核基质结合区(MAR)置于目的基因的两侧，降低不同转基因植株之间目的基因的表达水平。采用定点整合技术将外源基因定点整合进染色体转录活跃区域，降低转基因沉默的发生率，提高表达量。另外，优化植物表达载体的构成，尽量避免选用相同启动子的同时驱动外源目的基因、筛选基因和报告基因，以免发生同源抑制效应。采用低拷贝的农杆菌转染法也可在一定程度上减少位置效应的发生。

3.1.4 增强外源基因的翻译效率

可从多个方面进行目的基因的优化与改造，适当地添加植物特异的5’-非翻译序列、3’-非翻译序列和内含子序列，可增强目的基因产物mRNA的稳定性；根据植物偏爱的密码子且在不改变氨基酸序列的情况下改造目的基因的密码子及优化起始密码子周边序列，都可不同程度地提高外源基因的翻译效率，提高表达水平。

3.1.5 叶绿体转化

叶绿体基因组具有高拷贝性，定点整合进叶绿体基因组的外源基因一般可得到高效表达，可在一定程度上克服植物核基因组转化中出现的位置效应等引起的外源基因表达水平低、基因沉默，以及由于外源基因随基因转化植物花粉扩散而带来的不安全性等问题。马铃薯、香蕉等植物转基因后可以进行无性繁殖，不需要进行纯合系筛选，简化了育种手续，可以缩短育种时间，而且没有田间杂交的可能性，避免了抗生素等标记基因漂移引发的生物安全性问题。

3.2 增强免疫保护，避免免疫耐受的策略分析

口服抗原既有诱导产生免疫反应的能力，也能诱导产生口服免疫耐受。接种抗原的剂量是决定引起免疫反应或免疫耐受的主要原因。低剂量抗原易引起主动抑制，高剂量抗原易引起克隆清除和失能，由于转基因植物中表达的抗原蛋白量通常较低，所以有可能引起低剂量耐受。因此，提高外源基因的表达量是避免植物口服疫苗引起低剂量免疫耐受的关键策略之一。在实现外源基因在植物基因转化体中高效稳定表达的基础上，还可以通过将外源基因表达产物组装成类病毒颗粒等以提高抗原的抗消化能力，以及在适宜时机添加合适的粘膜免疫佐剂等方法增强植物口服疫苗的免疫保护能力、减少甚至避免免疫耐受的产生。

3.3 植物基因转化体的遗传稳定性

外源基因在受体植物内的遗传学行为非常复杂。大量试验结果表明，外源基因呈单基因显性孟德尔分离是其遗传传递中常见的现象，自花授粉后代表现3∶1酌分离规律，而与非转化亲本的杂交后代表现1∶1的分离规律。目前，常用的有农杆菌介导的T-DNA转化、DNA直接转化及生物种质转化等方法。DNA直接转化整合的外源基因在后代所呈现的遗传规律较复杂，稳定性较差；农杆菌介导的T-DNA转化法是人类对自然界天然遗传工程的利用，所整合的外源基因的完整性、可预见性和稳定性都优于DNA直接转化法，对能利用该法进行转化的植物受体而言是目前所能采用的首选转化方法。

3.4 安全性

虽然我国目前仍在研究转基因植物的安全性问题，但相信只要措施得当，人类还是有能力在不破坏生态平衡的前提下使转基因植物满足自身的需求，造福于人类。马铃薯、香蕉等植物转基因后可以进行无性繁殖，不需要进行纯合系筛选，简化了育种手续，可以缩短育种时间，而且没有田间杂交的可能性，避免了抗生素等标记基因漂移而引发的生物安全性问题。