实验动物皮肤病原真菌DNA快速少量提取法

刘福英

(河北医科大学 河北省实验动物重点实验室，石家庄 050017)

实验动物皮肤病原真菌DNA快速少量提取法

刘福英

(河北医科大学 河北省实验动物重点实验室，石家庄 050017)

PCR技术应用于实验动物皮肤病原真菌检测，方法简单、省时。但是，真菌的DNA提取较为困难。本文推荐一种既简单又经济快速的提取皮肤真菌DNA的方法，并能成功用于实验动物皮肤病原真菌质量检测研究。

实验动物;皮肤病原真菌;DNA提取

引起实验动物皮肤真菌病的病原菌，主要是羊毛状小孢子菌(Microsporum lanosum)、石膏样小孢子菌(Microsprum gypseum)和石膏样毛癣菌(Trichonohytom mentagrophytes)，以上三种真菌是哺乳类实验动物必须排除的皮肤病原菌。不论是从动物皮肤病灶处或非病灶处分离到这三种菌，均视为异常。因为，非病灶处的真菌很可能随后引起实验动物真菌感染，同时对饲养和实验人员构成威胁。

常规的对实验动物皮肤真菌检测程序主要包括，刮取动物皮毛鳞屑、沙氏培养基斜面培养、菌落观察、涂片镜检和报告结果。对可疑病灶，亦可刮取皮毛、鳞屑直接显微镜下观察。进而根据菌落形态和镜检特征及其生化特点，确定皮肤病原真菌菌种。这种方法要求检验人员具有多年的实践经验，熟悉掌握真菌菌种鉴别方法。由于真菌的表型特征很容易受到外界因素的影响，例如温度变化，培养基和化学治疗，这些都影响真菌代谢过程，尤其是皮肤癣菌的菌落易发生变异，加上检测人员的人为因素影响，都会影响检测结果。并且要得到典型的形态学和镜下特征一般需要2～3周的培养时间。对一些缺少特异的形态及镜下特征的菌种还需要进行特殊培养基的第二次培养，这样又将延迟几个星期的时间。因此，实验动物皮肤真菌的传统检测方法既费力又费时，不能满足准确、快速的目的。

以聚合酶链反应为基础的分子生物学技术克服了表型分型的不足，在真菌的分类和诊断方面显示出较大的优势和潜力。核酸检测方法，如PCR技术，已用于微生物鉴定和诊断研究［1，2］。虽然各种丝状真菌均能用于PCR扩增，同时真菌DNA的提取方法不断地改进。然而，因为真菌DNA提取的质量关系到最终的鉴定结果，因此DNA的提取方法得当与否，起很重要作用。到目前为止，已有多种真菌DNA提取方法，如使用破壁酶、玻璃珠法、使用研钵研磨的方法等，目的均是破坏真菌的细胞壁。如果这些方法用于大样本量的检测则显示出不足和缺陷，因为DNA的抽提过程步骤繁琐、耗时，并且其过程中还要设法避免真菌的污染，这常使工作人员疲劳和厌倦。

实验动物皮肤真菌的检测工作通常样本量较大，需要建立一种用于PCR方法真菌检测，快速、低耗并且获得可靠DNA的提取方法，以减少技术人员的工作量而且缩短检测时间。我们对照比较了几种DNA的提取方法［3－7］的优缺点，最后选择了一种快速、小量的真菌DNA提取方法。

该方法包括以下步骤:(1)用接种针从沙氏斜面固体培养基刮取少量病原真菌菌丝，放入1.5mL Ep管内，在未加入缓冲液前，用无菌牙签的尖端贴管壁轻轻搅拌，以破坏菌丝外层细胞壁。之后，加入 500 μL 缓冲液(400mmol/L Tris-HCl pH8.0，60mmol/L EDTA pH8.0，150mmol/L NaCl，1%SDS)，用漩涡震荡器充分混匀后，室温静置10 min。(2)加入150 μL 5 mol/L醋酸钾 pH 4.8(醋酸钾 60mL，冰醋酸11.5mL，蒸馏水 28.5mL)，简单混匀，离心15000 r/min，1 min，上清液移至1.5mL Ep管内，细胞碎屑及蛋白沉淀弃去，重复步骤(2)一次;然后上清液移至另一个1.5mL Ep管内。(3)加入等体积异丙醇，颠倒混匀，离心15000 r/min，5min，弃上清。(4)沉淀加入 500 μL 70%酒精，离心12000 r/min，1 min，弃上清，沉淀在室温下晾干，约10 min，使酒精挥发，加50 μL 无菌水溶解。取1 μL用于PCR扩增。

该方法用于实验动物皮肤真菌DNA的提取，整个步骤能在1 h内完成。目前我们在对普通级和清洁级实验动物皮肤病原真菌检测中，使用此方法对真菌的DNA进行了提取，在琼脂糖电泳中可看到清晰的DNA条带，使用真菌通用引物做PCR能扩增出清晰的目的产物［8，9］。以上结果表明这种快速、可靠、低成本的提取DNA的方法，可以用在实验动物的皮肤病原真菌的实验室研究和实验动物质量检测。

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A Rapid DNA Isolation Method from Pathogenic Dermatophytes in Laboratory Animals

LIU Fu-ying
(Hebei Key Lab of Laboratory Animal Science，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China)

The PCR technology is used in laboratory animal pathogenic dermatophytes detection，it is a simple and time saving method.However，the fungal DNA extraction is difficult.This paper recommends a simple，rapid and economic method for skin fungal DNA extraction;also this method can be used in the quality detection of pathogenic dermatophytes in laboratory animals.

Laboratory animal;Pathogenic dermatophytes;DNA extraction

R332

A

1671-7856(2010)09-0001-02

2010-01-25

刘福英，男，教授，主要研究方向:实验动物管理及人类疾病动物模型。E-mail:lfy5579@126.com。