副猪嗜血杆菌的分离鉴定与自家苗的制备

○河南科技学院 董永军 王丽荣 王宪文 王同燕 曲书哲 杭柏林 姚四新

随着世界养猪业的发展，副猪嗜血杆菌病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。该病可以影响从2周龄～4月龄的猪，主要在断奶后和保育阶段发病。通常见于5～8周龄的小猪，发病率一般在10%～15%，严重时死亡率可达50%。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱。主要剖检病变表现为纤维性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、关节炎和脑膜炎等。此外，副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。因此，分离副猪嗜血杆菌地方菌株，研制地方流行血清型的自家苗，对该病的预防、控制有重大意义。

笔者实习所在的预防兽医实验室从新乡5个患严重疑似多发性浆膜炎和关节炎病的猪场中，分离鉴定出副猪嗜血杆菌。选取分离鉴定出的10株副猪嗜血杆菌研究自家苗的制备方法。通过与患有该病的猪场合作，将所研制的疫苗对新引进的健康猪进行常规的免疫。通过疫苗对这些猪场新引进的健康猪保护力观察来验证该疫苗。因制苗菌株是从这些猪场分离的，抗原针对性强，对患有此病的猪场副猪嗜血杆菌病的预防、控制，起到很好的作用。

一、材料与方法

1.供试材料。

（1）病料。从新乡5个患有严重疑似多发性浆膜炎和纤维性关节炎病的猪场采集病料15份，病猪表现咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱。剖检病变表现为胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎。分别采取不同部位的病料，即呼吸道分泌物、血液、胸膜、心包膜或腹膜腔内的渗出物。

（2）试剂。葡萄糖、半乳糖、蔗糖、脲酶等生化微量鉴定管；营养琼脂，硫柳汞，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子），甲醛，金黄色葡萄球菌，吐温-80和司本-80，10号白油，硬脂酸铝，小白鼠。

（3）培养基。兔鲜血琼脂平板、巧克力琼脂平板、普通营养琼脂平板按常规方法制备。

2.试验方法。

（1）病原菌分离。在无菌操作条件下，将15份病料分别在巧克力琼脂平板和普通营养琼脂平板上划线接种，置于5%CO2培养箱中，37℃培养48h后，挑取疑似副猪嗜血杆菌单个菌落，再进行纯培养。

（2）涂片镜检。挑取上述纯培养疑似副猪嗜血杆菌单个菌落，分别涂片、革兰氏染色后，显微镜下观察菌体形态及染色结果。

（3）生化鉴定。V因子需要试验：在无菌条件下，分别挑取上述15份病料可疑菌落，水平划线于无NAD的兔鲜血平皿上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，置于CO2培养箱中37℃恒温培养24～48h，观察细菌的生长情况，即看是否有卫星生长现象，同时观察是否有溶血现象。

（4）生化试验。取具有卫星生长现象且不溶血的单个菌落纯培养后分别接种于添加NAD的含有葡萄糖、半乳糖、蔗糖、脲酶等的生化微量鉴定管中，置于CO2培养箱中37℃恒温培养24～48 h，观察生化反应和糖发酵活性结果，同时进行氧化酶试验和接触酶试验。

3.疫苗研制。用本实验分离鉴定出的副猪嗜血杆菌来研究油乳剂灭活苗制备方法，制备副猪嗜血杆菌油乳剂灭活苗。

（1）制苗菌株。选取从严重患病猪场分离并鉴定为副猪嗜血杆菌的菌株作为制苗菌株。

（2） 菌液的制备。将制苗菌株分别接种于巧克力琼脂平板上，于37℃培养24h，制成菌悬液，调整菌液浓度约为30亿个/mL，加入甲醛，37℃灭活48h。然后用灭活菌液接种巧克力琼脂平板上24 h，无菌生长时可备用制苗。

（3）油相的制备。副猪嗜血杆菌油乳剂灭活苗的油相为10号白油占94%(V／V)，司本-80占6%(V／V)。先将10号白油缓慢加温，至56℃左右时加入司本-80，边加热边搅拌，混匀后再加入总体积2%的硬脂酸铝，充分搅拌使其完全溶解，直至透明，避免出现黏性胶冻样物。然后，过滤，分装，高压灭菌30min，即为油相，冷却后备用。

（4）水相制备。取灭活菌液和吐温-80，按适当比例充分混匀后，即为水相，置4℃备用。

（5） 乳化和分装。取油相3份置匀浆机内，慢速搅拌，同时徐徐加入水相1份，然后加速搅拌，加完后再以10000r/min搅拌3min，使水油充分乳化，制成油包水型油乳剂。在终止搅拌前加入硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01%。然后，定量分装，加盖密封。

4.疫苗物理性状的检验。

（1）黏度测定。用1mL口径为1.2mm的吸管，在室温下吸满1mL乳剂，以吸管垂直状态时放出0.4 mL疫苗所需要的时间作为判定标准，在2～6s内流出，则为稀薄乳剂，超过6s以后流出，则为较稠乳剂，稀薄乳剂为合格。

（2）稳定性测定。取副猪嗜血杆菌油乳剂灭活苗1.5mL加入离心管，以3000r/min离心15min，以不分层为稳定性良好。

（3）剂型检查。取洁净的吸管，吸取少量油乳剂灭活苗分别滴入加水和加白油的平皿中，然后用牙签搅拌，如果不溶于水而溶于白油，则可判定为油包水型，否则判为水包油型。

5.疫苗质量检验。

（1）疫苗无菌检验。将油乳剂灭活苗取0.1mL接种于巧克力琼脂平板上，37℃培养48h检查细菌生长情况。

（2）生物安全试验。取6只体重为10～20g的小白鼠（雌雄各半），皮下注射油苗0.5mL/只，连续观察7d，查看反应情况。

（3）效果检查。通过与患有严重该病的猪场合作，将所制的副猪嗜血杆菌油乳剂灭活苗对新引进的160头健康猪进行常规的免疫，连续观察60d看是否有发病情况。

二、结果与分析

1.细菌分离培养、形态观察结果。将纯化好的细菌分别接种于巧克力琼脂平板和普通营养琼脂平板，37℃培养48h后，观察到普通营养琼脂平板上没有生长菌落；巧克力琼脂平板上生长出边缘整齐、小而透明的菌落。

取上述菌落抹片、革兰氏染色后在显微镜下观察，有大小不等，短小杆状、球杆状、丝状等多种不同的形态细菌，革兰氏染色为阴性。

通过细菌的分离培养与形态观察，初步判定该细菌为副猪嗜血杆菌，要确诊需进一步进行生化试验。

2.分离菌株生化试验结果。V因子需要试验：可见10株分离细菌在金黄色葡萄球菌周围生长出灰白色、半透明、圆形、边缘整齐的小菌落，而越远离者则菌落越小，甚至不生长，表明10株有卫星现象，均为NAD生长依赖菌；其他5株不具有卫星现象。而且此15株细菌都不溶血。

根据卫星生长现象，结合生化实验结果可以看出，分离的10株符合副猪嗜血杆菌特性，确诊为副猪嗜血杆菌。其余5株不是副猪嗜血杆菌。

3.疫苗研制结果。

（1）黏度检查结果。在室温下吸满1mL油苗，以吸管垂直状态时放出0.4mL疫苗所需要的时间为5s，不超过6s为稀薄乳剂，黏度为合格，适合注射用。

（2）剂型检查结果。所制疫苗易溶于白油而呈均匀分散状态，在水中呈油滴状，不散开，为油包水油乳剂。

（3）稳定性检查结果。所制疫苗于离心管中3000r/min离心15 min，未出现分层和破乳现象，说明试制疫苗合格。

（4）无菌检验结果。将油乳剂灭活苗接种于巧克力琼脂平板，37℃培养48h，无菌生长。

（5）生物安全试验。6只小白鼠皮下注射油乳剂灭活苗连续观察7d，精神和食欲未见异常。

（6）效果检查结果。通过和新乡患有严重副猪嗜血杆菌病的猪场合作，将所制的副猪嗜血杆菌油乳剂灭活苗对新引进的160头健康猪进行常规免疫，连续观察60d，其保护率达到96.9%。

通过细菌的分离培养与形态观察以及生化试验，可确诊所分离的10株细菌为副猪嗜血杆菌，对所制得的疫苗进行质量检验和安全性检验，均符合要求，效果检查结果也表明起到了很好的保护效果，证明本实验是成功的。

三、小结

副猪嗜血杆菌是上呼吸道中一种常在菌，故确诊是否由副猪嗜血杆菌感染引起的病例，必须从浆膜、心包、腹膜、关节和脑膜等全身各部位采样、送检才能进行本菌感染诊断，而且进行病原分离时，要选择具有代表性的样品才能作出正确诊断。本实验从新乡5个患严重多发性浆膜炎和关节炎病的猪场中采集病料15份，结合临床症状和剖检病变的观察，通过在巧克力培养基上分离细菌并进行培养，然后涂片镜检，进行生化实验等一系列的实验室检查，分离鉴定出10株副猪嗜血杆菌。用分离鉴定的10株副猪嗜血杆菌，制备了副猪嗜血杆菌的油乳剂灭活苗。

通过和新乡几个患有严重该病的猪场合作，将所制得的自家苗对新引进的160头健康猪进行常规免疫，结果表明，自家苗对这些猪场该病的防治取得了很好效果。