γ-氨基丁酸对人末梢血γ δ T细胞作用的实验研究

何晓华,刘世育

(江苏省徐州市第一人民医院消化内科 221000)

γ-氨基丁酸对人末梢血γ δ T细胞作用的实验研究

何晓华,刘世育

(江苏省徐州市第一人民医院消化内科 221000)

目的研究γ-氨基丁酸(GABA)对人外周血γ δ T细胞的增殖、细胞周期、凋亡的变化、杀伤活性的影响及其可能的作用机制。方法在体外用不同浓度的GABA与人γ δ T细胞作用后,用MT T比色法和流式细胞仪(FCM)以及乳酸脱氢酶(LDH)法分别检测人γ δ T细胞的增殖能力、T细胞周期、凋亡和杀伤活性的变化。结果GABA能显著抑制γ δ T细胞的生长(P＜0.01),并具有浓度依赖性;GABA显著影响细胞周期比例的分布,促进细胞凋亡;GABA抑制γ δ T细胞对人胰腺癌细胞株SW-1990的杀伤活性。结论GABA能显著抑制γ δ T细胞的增殖,抑制γ δ T细胞的杀伤活性。提示GABA可能是通过影响细胞周期及凋亡对γ δ T细胞发挥作用,进而影响其杀伤活性。

γ-氨基丁酸;γ δ T 细胞;凋亡;杀伤活性

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质,它不仅存在于中枢神经系统中,而且广泛存在于外周神经组织及非神经组织细胞中[1]。有研究发现,免疫系统的许多淋巴细胞表达神经活性分子的受体,调节免疫和神经系统之间的相互作用。最近研究证实,CD4+和(或)CD8+T淋巴细胞上表达GABAA受体,GABA与其A受体结合能够抑制抗原特异性T细胞活化,具有免疫抑制作用[2]。然而,对于 T细胞的另一亚群γ δ T细胞与神经系统之间的相互作用的研究较少。γ δ T细胞是固有免疫的一个重要细胞群,它广泛分布于消化系统和呼吸系统上皮组织内,末梢血中也有一定的数量。自从1990年Zocchi等[3]首次从2例肺癌患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中分离出γ δ T细胞,并观察到对自体肿瘤细胞有较强的杀伤性之后,又有文献报道γ δ T细胞对许多肿瘤细胞系的杀伤作用[4-5]。本实验应用GABA作用于人γ δ T细胞,研究其对细胞增殖、细胞周期和对 SW-1990人胰腺癌细胞的杀伤活性的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI1640干粉为Gibco公司产品,人AB型血清购自徐州市血站,胎牛血清和淋巴细胞分离液购自中国科学院血液学研究所,Hepes(Amersham公司产品)购于天来生物医学科技有限公司,异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)、GABA、四甲基偶氮唑蓝(MT T)、二亚甲砜(DMSO)均购自Sigma公司,IL-2购于厦门特宝生物工程股份有限公司,SW-1990人胰腺癌细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所。流式细胞分析仪(TACS Calibur)为美国 BECTON DICKINSON公司产品,恒温CO2培养箱(Heraeuas公司)、倒置显微镜为德国Wilovert公司产品,SEAC全自动酶免系列分析仪和配套的LDH试剂盒为北京希亚克技术有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 γ δ T细胞的培养及收集 取健康献血者末梢抗凝血10 mL,加入淋巴细胞分离液,以 2 000 r/min离心15 min,吸取单个核细胞层,用生理盐水洗涤3遍(1 500 r/min离心,每次10 min),加入 RPMI1640培养液中(含10%小牛血清、5%人AB血清),IPP 3 ng/mL和 IL-2 100 IU/mL,调整细胞数为1×108/L,置75 cm2细胞培养瓶中,于37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养,根据细胞生长情况及时添加培养液。取细胞培养瓶以1 500 r/min离心5～ 6 min,弃上清液,收集培养的 γ δ T细胞加入新鲜的RPMI1640培养液配成所需浓度的细胞悬液备用。

1.2.2 SW-1990胰腺癌细胞培养 将人SW-1990胰腺癌细胞株置含10%的小牛血清RPM I-1640培养液中,于37℃、5%CO2条件下培养,细胞贴壁生长良好,每2～3天传代1次。

1.2.3 M TT法检测 GABA和 PTX对γ δ T细胞增值的影响实验分为不同浓度的GABA组和对照组。GABA的浓度为10、100、200、400、800、1 600、3 200 μ mol/L;对照组用等体积的RPM I-1640代替,取刚收集的 γ δ T 细胞配成1×105/mL,分别接种于96孔板中,每孔0.2 mL,加入不同浓度的GABA,每组设3个复空,于37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养,每2天半量换培养基及加入相对等的药物,继续孵育10 d后每孔加入MTT液20 μ L,37℃孵育 4 h后弃上清液,每孔加入 DMSO 150 μ L,轻轻振荡10 min使甲瓒充分溶解,在 540 nm 波长酶标仪上测定各孔光密度(OD)值,求其平均值;同时计算细胞增殖抑制率。

1.2.4 GABA对γ δ T细胞凋亡和细胞周期影响的检测 收集γ δ T细胞,1 500 r/min离心5 min,70%冷乙醇固定,离心后加入PI染液1 mL(生理盐水 129.6 mL,PI 100μ g,RNA酶 2 mg,Triton-X-100 1 mL,枸橼酸钠 200 mg,加双蒸水至200 mL)4℃避光染色30 min,用流式细胞仪检测,每个样本分析10 000个细胞。

1.2.5 LDH 法检测GABA对γ δ T细胞杀伤SW-1990胰腺癌细胞活性的影响 将SW-1990胰腺癌细胞用RPMI-1640培养基培养至对数增殖期,收集细胞用 Hank′s液洗2次,配成2×105/mL;效应细胞(γ δ T)配成 2×106/mL,将效、靶细胞数按10∶1比例混合。无菌塑料管3支各加入胰腺癌细胞悬液0.5 mL。测定管加入经GABA作用的γ δ T细胞悬液0.5 mL。对照组用未经GABA作用的γ δ T细胞,设靶细胞自然释放管(SW-1990细胞加0.5%BSA-RPMI-1640 0.5 mL)及最大释放管(SW-1990细胞加 1%NP400.5 mL),每组设 4管。以 500 r/min离心 5 min,置37℃5%CO2培养箱中孵育 5 h后,轻轻混匀细胞,再以1 500 r/min离心 10 min。收集上清液,用 Encore全自动生化分析仪,测定 LDH 的活性单位(u/L)。γ δ T细胞杀伤活性=(测定管 LDH单位-靶细胞自然释放 LDH单位)/(最大释放管LDH单位-靶细胞自然释放管LDH单位)×100%。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件,数值以±s表示,采用两组均数t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GABA对γ δ T细胞增殖的影响 GABA能显著地抑制γ δ T细胞的生长(P＜0.01),呈剂量依赖性,见表 1。

表1 GABA对γ δ T细胞生长的影响(n=3)

2.2 GABA对γ δ T细胞凋亡和细胞周期影响的检测 GABA能显著促进γ δ T细胞的凋亡,细胞凋亡比例从 14.84%到35.46%。随着药物浓度的增高,G0/G1期细胞比例逐渐增加,G2/M、S期细胞比例逐渐下降,呈剂量依赖性(P＜0.05),见表2。

2.3 GABA对γ δ T细胞杀伤活性的影响 GABA可以抑制γ δ T细胞对SW-1990胰腺癌细胞株的杀伤活性,呈浓度依赖性(P＜0.01),见图 1。

表2 GABA对γ δ T细胞周期及凋亡的影响(±s,%,n=3)

表2 GABA对γ δ T细胞周期及凋亡的影响(±s,%,n=3)

与对照组及各浓度组之间比较,#:P＜0.01。

组别 G0/G1 G2/M S 凋亡率对照组(GABA 0 μ mol/L) 38.87±1.38 13.45±0.89 47.67±2.26 14.62±0.60 GABA 200μ M 组 39.43±3.40 10.94±2.45# 49.28±3.77# 14.32±0.34 GABA 800μ M 组 34.75±3.51# 9.63±0.49# 55.62±3.91# 28.99±1.20#GABA 3 200μ M 组 30.04±1.17# 7.30±0.85# 62.65±0.97# 35.39±0.90#

图 1 GABA对γ δ T细胞杀伤活性的影响

3 讨 论

在人类外周淋巴器官及血液中的多数 T细胞属于α βT细胞,这些α β T细胞来源于骨髓的多能造血干细胞,并且在胸腺中分化为CD4+和(或)D8+T细胞,随后定居于外周淋巴器官发挥其生物学作用。1984年Saito及其研究小组首次发现在正常外周血淋巴细胞中除了占绝大多数的α βT细胞群之外,还有一群为数只占不到T细胞总数5%的、由γ和δ链基因编码T 细胞受体(TCRs)的T 细胞,即γ δ T 细胞。 与α β T 细胞不同,γ δ T细胞主要分布于皮肤、肺、肠、生殖泌尿道等器官。多年来的研究发现,γ δ T细胞在抗炎症、抗病原体、抗肿瘤等方面发挥了巨大的作用[6]。国内以往在体外培养扩增γ δ Σ细胞通常用γ δ TCR单克隆抗体固相包被、结核杆菌低分子多肽抗原诱导、HSP70多肽诱导和磷酸脂配体诱导等方法[7]。作者应用IPP和IL-2共刺激法在体外培养10 d时γ δ T细胞的比率从培养前4.21%升至 70.35%,γ δ T细胞增殖倍数达100倍。此足量的高纯度的γ δ Σ细胞基本上满足了目前研究和临床应用的需要[8]。

自20世纪90年代以来,越来越多的证据显示神经递质受体在非神经组织的表达,就免疫系统而论,尽管巨噬细胞、树突状细胞(DC)、B细胞和自然杀伤细胞(NK)也表达神经递质受体,但是研究者的兴趣大多集中在胸腺细胞和T细胞上。经典神经递质受体如苯二氮 类受体、乙酰胆碱受体、谷氨酸受体、GABA受体、甘氨酸受体等在CD4+和(或)CD8+T细胞上的表达均有报道,其受体激动剂或拮抗剂对T细胞的分化、成熟及其分泌细胞因子(如 IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TGF-α)等方面均有不可忽视的影响[9],但是关于γ δ T细胞与神经递质的相互作用国内外报道较少。

GABA主要有 A、B、C 3种受体亚型,A和C受体是配体门控离子通道超家族(ligand-gated ion channel superfamily)成员,A受体是异聚体Cl-离子通道,可被生物碱、Picrotoxin等阻断。B受体是七跨膜偶联G蛋白受体家族,可激活第2信使系统及Ca2+和K+通道。Sabina等[2]最近研究发现人类外周血T细胞上表达GABA受体,并且可以对T细胞发挥一定的调节作用。本实验用GABA对γ δ T细胞的影响研究表明,GABA可抑制γ δ T细胞的生长,并且在第1天加入GABA 时有作用,当培养7 d加入时却无此作用。此结果表明GABA对γ δ T细胞增殖的抑制作用是在IPP激活前发生的,对 IPP激活后的γ δ T细胞无明显作用。

与Tian等[10]报道结果一致,本研究发现 GABA 对γ δ T细胞的细胞周期也有一定的影响。不同浓度GABA作用后,G0/G1期细胞比例明显上升,G2/M期、S期细胞比例降低,结果提示GABA能够抑制γ δ T细胞生长,影响细胞周期进程,使γ δ T 细胞停滞在G0/G1期,并且显著地促进 了 γ δ T 细胞凋亡 。因此,GABA是通过促进细胞的凋亡,影响细胞周期发挥作用的,但不排除通过A、B、C受体或其他途径实现,其具体机制尚有待于进一步研究。这些实验结果也从侧面反映了γ δ T与α βT细胞之间的相似之处。

γ δ-TCR 和 NKG2D 是 γ δ T 细胞上表 达的主 要与炎 症 、肿瘤等免疫相关的两类主要的受体,其杀伤活性与肿瘤细胞表达的配体如MICA/MICB、ULBP1-4等密切相关[11]。对杀伤活性的研究发现,GABA可以抑制γ δ T细胞对 SW-1990胰腺癌细胞株的杀伤,并呈剂量依赖性。此结果表明,γ δ T细胞的杀伤活性可能主要是通过γ δ-TCR介导的,是否也通过 NKG2D等其他途径目前尚不清楚。至于GABA通过何种途径影响γ δ T细胞表面受体的表达、如何对肿瘤细胞发挥作用尚须深入的研究。

上述实验资料表明,GABA对γ δ T细胞的影响可能与多种途径有关,深入认识其作用和作用机制,对于解释γ δ T细胞的功能及其与神经递质间的相互作用具有重要的理论意义和临床应用价值,而且对于阐明γ δ T细胞对于肿瘤细胞的杀伤活性的临床作用基础也具有重要的参考价值。另外还可以为神经、内分泌、免疫系统之间相互作用提供证据。

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Effects of γ-aminobutyric acid on human peripheral blood γ δ T cells in vitro

HE Xiao-hua,LIU Shi-yu

(Department of Gastroenterology,the First People′s Hospital of Xuzhou,Xuzhou,J iangsu221000,China)

ObjectiveTo research the effects of GABA on proliferation,cell cycle,apoptosis,cytotoxicity and possible mechanism of action of human peripheral blood γ δ T cells.MethodsUsed the isopentenyl pyrophosphate(IPP)method to amplify human peripheral blood γ δ T cells in vitro.After different doses of GABA to treat with γ δ T cells,M TT method was used to detect the proliferation of γ δ T cells;And then investigated the cell cycle and apoptosis of γ δ T cells by flow cytometry;Meanwhile,measured to cytotoxicity of γ δ T cells by lactate dehydrogenase method.ResultsGABA could decrease the proliferation of γ δ T cells in a dosedependent manner(P＜0.01).The cell cycle of γ δ T cells was greatly affected by treated with GABA,and the apoptosis was increased.GABA could restraintγ δ T cells killing the SW-1990 cell line.ConclusionGABA may effect on γ δ T cells through cell cycle and apoptosis,and then affect the cytotoxicity of γ δ T cells.

γ-aminobutyric acid;γ δ T cells;apoptosis;cytotoxicity

R741.02;R338

A

1671-8348(2010)07-0804-03

2009-08-17

2009-09-28)

◦论 著◦