疟疾候选疫苗研究进展情况综述

黄加忠 李 靖

疟疾是一种古老的传染病，也是热带和亚热带地区危害最严重的传染性疾病之一[1]。通过携带有疟原虫的按蚊叮咬感染人，疟原虫子孢子进入人体，在肝脏内发育增殖后释放入血，一部分被吞噬细胞吞噬，一部分侵入红细胞内进行裂体增殖。主要引起发热、贫血、脾肿大及肾脏损害；在恶性疟疾高流行地区，5岁以下儿童、孕妇、HIV患者以及无疟疾免疫力人群易引发凶险型疟疾，若未及时治疗或处理不当，易造成部分患者死亡。目前疟疾仍流行于100多个国家、近一半的世界人口仍然面临感染疟疾的危险，每年至少有3亿人感染疟疾，近300万人死亡[2]。流行病学调查发现，曾经感染过疟疾的个体中存在低效率和短暂性的保护性免疫，提示主动免疫可能为疟疾的防治提供帮助[3]。自20世纪70年代以来，研究人员通过建立疟疾感染动物模型和志愿者参与的研究发现，研制使用相关疫苗以预防疟疾的发生是可行的，部分疫苗也进入临床试验阶段。现将疟疾候选疫苗研究进展情况综述如下。

1 红细胞前期疫苗

疟疾的红细胞前期包括疟原虫子孢子入侵宿主并进入宿主的肝细胞，在肝细胞中进行裂体增殖而成为肝期的裂殖体。针对此阶段的疫苗主要作用就是诱导宿主产生高水平的抗子孢子抗体，阻止子孢子进入机体：子孢子侵染肝细胞后，可诱导机体产生细胞免疫，由细胞毒性T淋巴细胞和其他细胞因子杀死感染的肝细胞内子孢子，从而达到阻止子孢子侵入并且清除的目的。

1.1 射线照射减毒处理的子孢子[4]

使用经射线照射减毒处理的子孢子对实验动物和志愿者进行接种免疫，证明有免疫保护效果。照射减毒处理的子孢子可以正常侵染肝细胞，但不能像未经处理的子孢子一样进行核分裂发育成熟并继续感染红细胞，减毒子孢子可以存在于肝细胞内数周至数月，此时感染的肝细胞可以诱导机体产生细胞免疫和抗体介导的保护性免疫，这些免疫效应物质的靶点就是感染的肝细胞。尽管全虫体减毒疫苗表现出良好的免疫原性，但是它的安全性、合适的照射剂量、疫苗的规模生产以及储存等问题极难解决，接种所带来的保护周期最长为1年[5]，这些问题使得射线照射减毒子孢子疫苗难以推广。

1.2 遗传性改变的疟原虫

Mueller等[6]采用打靶剔除疟原虫的UIS基因的方法，获得减毒的红前期疟原虫。研究中以伯氏疟原虫基因组DNA为PCR模板，扩增UIS3基因的5'和3'非编码区域，最终在NMRI小鼠中克隆被剔除了UIS3基因的伯氏疟原虫，定名为UIS3（-）。在肝细胞中，子孢子向滋养体转型的初期不需要UIS3基因，但滋养体的进一步发育以及发育到红前期裂殖体需要UIS3基因，只有很少一部分的UIS3（-）子孢子能转型至球形的红前期滋养体，但个体小且不能发育为成熟的红前期裂殖体。用高达10万个UIS3（-）子孢子感染SD大鼠后，未检出红内期的疟原虫。UIS3（-）子孢子以不同接种剂量、不同接种方式（静脉或皮下）、不同免疫流程免疫C57BL/6小鼠，然后用野生型子孢子静脉攻击或感染性蚊虫叮咬，检测实验小鼠的外周血原虫血症。所有组别的实验结果都显示UIS3（-）子孢子具有消除性免疫保护作用，并有很好的持久性。有的学者也采用了同样的方法打靶踢除UIS4、P36p基因，获得减毒子孢子，作为疫苗，也取得成功[6-8]。

1.3 红细胞前期亚单位疫苗

1.3.1 环子孢子蛋白疫苗

Enea等[9]采用DNA重组技术克隆出环子孢子蛋白（CSP），并被确认为是有保护性的靶抗原，此项成果大大激发了研究人员的热情，在此后的若干年中至少有20种以上的重组抗原被确认同样具有免疫原性[10]，这些都被作为候选疫苗进行研究并取得进展。CSP蛋白是针对该期原虫的重要靶抗原，相应的抗体可阻止子孢子的进入。CSP分子中央区域存在重复区，两侧区域是区域Ⅰ和区域Ⅱ，含有与肝细胞结合的功能域[11]。以CSP为基础的RTS、S候选疫苗己取得了成功。RTS、S恶性疟3D7株编码环子孢子蛋白207～395氨基酸序列与乙型肝炎表面抗原氨基端基因融合而成，表达单一链的蛋白，CSP包含19个NANP重复序列及其C末端。与佐剂AS02A混合，可诱导出高水平的针对环子孢子中央重叠区的抗体，并能诱导出Thl型细胞反应。美国GSK生物公司（GSKBio）和美国陆军医学研究院（WRAIR）合作开展了该疫苗的临床前和临床试验。Ⅰ/Ⅱ期临床试验结果显示该疫苗在人体中是安全的，并能产生强免疫反应。然而，这种保护性免疫持续时间很短，当6个月后再次感染时，绝大多数自愿者已失去原有的保护力[12]。西班牙巴塞罗那大学的热带病专家Pedro Alonso等对94个莫桑比克乡下婴儿在10、14及18周时分别注射了RTS、S，并与对照组进行比较。结果发现，注射了RTS、S的婴儿患疟疾的概率比对照组婴儿要低65%，且不良反应并不比普通接种疫苗多[13]。科研人员采用人工合成长肽方法产生了102个CSP C末端的合成肽，经与铝佐剂和ISA720佐剂乳化后进行Ⅰ期临床试验。结果显示，该疫苗具有高免疫原性，刺激机体产生识别子孢子的体液免疫和细胞免疫反应。

1.3.2 ME-TRAP疫苗

该疫苗由一个多表位片段（ME）和血凝素相关黏附蛋白（TRAP）融合而成，含6种来自红前期抗原和两个B细胞表位。TRAP是一种跨膜蛋白，与子孢子的运动性及感染性有关。先用DNA质粒进行初次免疫，然后用病毒载体抗原进行加强免疫，能有效的诱导T细胞免疫。Ⅰ和Ⅱa期临床试验显示：部分自愿者延迟出现原虫血症，并有部分自愿者获得保护[14]。

1.3.3 肝期抗原1 （LSA-l）

LSA-l是目前已知的惟一的肝侵染期特异性分泌蛋白，子孢子侵染肝细胞后，形成纳虫空泡内腔。流行病学调查显示，接触过疟原虫的个体对LSA-l抗原有免疫反应。重组表达的LSA-l候选疫苗已经进入临床试验的Ⅰ～Ⅱa阶段，受试对象在接受疟原虫暴露后，免疫强化组均得到免疫保护，未出现延迟原虫血症[15]。

1.4 红细胞前期的DNA疫苗

DNA疫苗属于新一代疫苗，具有亚单位疫苗和全虫疫苗的优点，生物性质稳定。动物实验中发现，接种DNA疫苗后，能诱导动物产生较高水平的特异性体液免疫和细胞免疫反应。Eric等[16]构建了一种可表达6种候选抗原的DNA疫苗，研究表明，接种此疫苗后，能产生针对恶性疟原虫的T细胞免疫。

2 红细胞内期候选疫苗

在此阶段，由肝细胞释放出的裂殖子侵入红细胞，进行裂体增殖。由于大部分时间存在于红细胞内，只有较为短暂的时间游离于血液中与宿主免疫系统接触诱导产生抗体依赖和细胞介导的免疫反应，因此裂殖子表面蛋白和顶端复合体抗原成为研究的焦点，多种抗原被作为候选疫苗进行研究。主要有AMA-1（顶端膜抗原1）、MSP-1、MSP-2、MSP-3、MSP-4（裂殖子表面蛋白1/2/3/4）、GLURP-1（谷氨酸富含蛋白1）、RESA（环状体感染红细胞表面抗原）、SERA5（丝氨酸富含蛋白5）、EBA-175（红细胞结合抗原）、EBP-2（红细胞结合蛋白2）、RAP-2、EMP-1（恶性疟原虫红细胞膜蛋白）以及DBL-a（Duff结合样区域a）。

2.1 MSP-1候选疫苗

MSP-1是一前体蛋白，相对分子质量为195×103，可分裂成4个片段，从N端至C端，依次裂解为相对分子质量为83×103、（28～30）×103、（36～41）×103和42×103片段。第二次裂解在裂殖子侵入红细胞前，C末端的相对分子质量为42×103段（MSP-l42）再被裂解成相对分子质量为33×103和19×103两个片段，仅C末端的相对分子质量为19×103片段（MSP-l42）随裂殖子进入红细胞。MSP-l42一般认为与裂殖子进入红细胞的过程有关。用恶性疟3D7株的MSP-142与AS02A佐剂结合，在非疟疾流行区人群中进行的临床试验，显示其有很好的安全性和较强的免疫原性。在Ⅱa攻击试验中，MSP-l42单独使用或与RTS、S/AS02A联合使用都未能显示出其具有抗感染的保护作用。肯尼亚疟疾流行区成人中Ⅰ期安全性试验已顺利完成，计划在西肯尼亚疟疾流行区对l～4岁儿童中进行Ⅰ期临床试验。

2.2 AMA-l候选疫苗

美国过敏与传染病研究所将从恶性疟原虫3D7株和FVO株表达的重组蛋白等量混合，命名为AMAl-Cl，Ⅰa期临床试验采用的的是AMAl-C1/铝胶佐剂，目前正在马里采用AMA1-Cl/铝胶佐剂+CPG7909针对成人进行Ⅰb期试验，针对儿童的Ⅰ/Ⅱb期安全性及有效性试验正在进行。

2.3 GLURP候选疫苗

该疫苗是恶性疟原虫表达的蛋白，在红前期及红内期均可见。GLURP85-213核酸片段常被选择用于合成长链肽，在其中包含P3抗原决定簇，可与抗体在体外试验中表达强烈的生物学效应，Ⅰ期临床试验表现出较好的免疫原性和安全性[17]。

2.4 SERA候选疫苗

SERA候选疫苗分子量较大，可裂解成3个抗原片段，分别是相对分子质量18×103、47×103和50×103，日本正在作基于SERA抗原的疫苗Ⅰ期试验。

上述候选疫苗目前全部进入临床试验并取得阶段性成果，鉴于裂殖子侵入宿主细胞过程中有多种蛋白参与，因此单一采用疫苗的保护性将很弱，甚至可能有免疫逃逸现象，故研究采用多种抗原混合制备疫苗，但是多种蛋白混合使用，是否会导致相互间的拮抗?因此采用基因重组表达的方式构建融合蛋白可能是形成最终疫苗的良策。上海第二军医大的疟疾疫苗课题组在国内成功构建了恶性疟原虫红内期融合蛋白PfCP-2.9，该抗原与ISA720佐剂混合后免疫实验动物取得很好的效果，目前也正在进行临床试验。

3 有性生殖期候选疫苗（传播阻断性疫苗）

通过阻止疟原虫在蚊虫体内的有性增殖而达到阻断疟疾传播的目的，在这个过程中，虽然不能使个体免于疟疾感染，也不能减轻症状，但能阻断蚊虫将疟原虫从一个宿主传播至另一个宿主，并可用于旅行者的免疫，以避免将疟原虫从疫区带回，造成本地区流行的后果。目前针对此过程候选疫苗研究较少。在诸多的文献中仅见有Hisaeda报道了Pvc25可能是间日疟原虫较理想的传播阻断疫苗候选抗原。

4 基于基因组学和蛋白质组学的疟疾疫苗

传统的疫苗研究方法是通过生物化学、免疫学及微生物学的方法对病原体进行分析，最终获得有效的疫苗，基因组学的疫苗设计能够从数据库中直接选取相关序列，预测抗原，并且这个过程不需要依赖体外培养病原体。1996年恶性疟原虫基因组数据库诞生，为选择更多有效的疟疾疫苗提供有力的帮助。蛋白质组学的方法则可采用特定位点重组克隆技术消除了核酸内切酶和连接酶的使用限制，提供了适合高通量过程的一些优势。20世纪80年代成功克隆表达了恶性疟CSP蛋白后，在很短的时间采用同样的方法发现了众多的候选疫苗。反向疫苗技术就是利用了基因组学、蛋白质组学以及转录组学的信息，高通量的筛选有效保护性成分。Mu等[18]采用了基因组学技术分析了未知靶抗原蛋白多态性，并最终成功获得新的候选疫苗。

5 结 论

疟原虫生活史复杂，在不同的时期表达不同的抗原，没有主导抗原，导致疟原虫易逃逸宿主免疫攻击。目前研究发现有近50种候选抗原，但是每一种抗原作为疫苗接种后，产生不了持久强大的免疫保护；动物实验与临床试验的结果不一，提示疟原虫感染宿主后，由于宿主的种属不同可能存在不同的免疫机制，所以需要加强疟原虫免疫机制的研究；在选择疫苗时需要针对疟原虫的不同生活期，选用多种复合抗原，需通过基因重组的方法制备融合抗原；同时需进行免疫佐剂研究，包括一些可以增强免疫活性的细胞因子。

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