人偏肺病毒研究进展

李雪辉，陈杭薇



人偏肺病毒研究进展

李雪辉，陈杭薇

100700 北京军区总医院呼吸内科

人偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV）是新近发现的一种呼吸道致病病毒，2001 年首次在荷兰一婴儿的鼻咽部抽吸物中被分离得到，根据它的形态学、生物化学以及基因学特点，hMPV 一开始被分类为禽偏肺病毒，禽偏肺病毒可以引起火鸡和其他鸟类的上呼吸道感染，现在普遍认为 hMPV 属于肺病毒亚科的副黏病毒。副黏病毒除了 hMPV，还包括禽流感病毒以及人合胞病毒。

1 病原学

hMPV 是一个有包膜的大约 13 kb 单股负链 RNA 病毒，序列与禽偏肺病毒相似，hMPV 基因3’~ 5’ 的序列为 N-P-MF-M2-SH-G-L。M 基因 mRNA 编码两个重叠的开放性阅读框 M2-1 和 M2-2，与人合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）一样[1]。hMPV 编码蛋白如下：N，核衣壳 RNA 结合蛋白；P，核衣壳磷蛋白；M，非糖基化基质蛋白；F，融合糖蛋白；M2-1，转运延长子；M2-2，RNA 合成调节因子；SH，小的疏水表面蛋白；G，主要黏附蛋白；L，主要聚合亚单位。其中融合蛋白 F 具有抗原决定簇，是疫苗研制的着眼点，hMPV 感染进入细胞也是通过 F 蛋白调节的膜融合方式。偏肺病毒有编码核衣壳蛋白 N、L 的基因，但缺乏非结构蛋白 1 和 2 （nonstructural protein，NS），这与呼吸道合胞病毒相似。hMPV 不凝集红细胞，与呼吸道合胞病毒和麻疹病毒等的基因同源性很低，而与禽肺病毒 C 型有较高的同源性。

hMPV 颗粒呈多形性，球状形或丝状形，其中球状形颗粒尺寸不均一，平均直径 209 nm，丝状形 282 nm × 62 nm，包膜突起 13 ~ 17 nm，核壳体平均直径 17 nm，核壳体长度小于 200 ~ 1 000 nm。

通过对一些不同的临床分离标本 F 和 G 基因序列进行比较，把 hMPV 分为 A 和 B 两个亚组。A 和 B 亚组的 F 蛋白基因高度保守，其氨基酸同源性大于 95%，而 hMPV 的 G 蛋白基因则变化很大，氨基酸同源性很低，只有 35%[2]。hMPV 的 A、B 两个基因型又分别分为 A1、A2 和 B1、B2 两个亚型。hMPV 两种基因型无交叉免疫保护。

2 流行病学特征

hMPV 的传播途径可能与 RSV 相似，通过呼吸道飞沫、或者手—口、手—眼接触污染的物体表面传播。hMPV 的季节流行性与 RSV相似，为从冬季到春季。虽然目前对于 hMPV 所致疾病还不是完全清楚，但是研究显示它的感染一般紧随在早或中冬时节的 RSV 和流行性感冒病毒的感染后，在晚冬和初夏副流感病毒的感染之前。血清抗体阳性率显示 hMPV 在全世界流行，可以感染儿童、老人、免疫缺陷者，尤其以儿童为主要感染对象，调查显示 70% 的儿童已经有 hMPV 抗体[3]。

全世界各国的感染率变化范围很大，在 1.5% ~ 41% 之间，hMPV 初次感染一般发生在小于 2 岁的儿童，尤其是小于 12 个月的幼儿为主。对于大龄儿童和成人来说，感染人群主要是免疫抑制剂使用者和器官移植者，或者有慢性肺部疾病的患者。hMPV 感染被认为是器官移植者的主要致病因子。

德国 Wilkesmann 等[4]的研究表明，637 例患者中，hPMV 阳性占17. 9%，其中 50% 以上患儿年龄大于 12 个月，45.5% 患儿至少有 1 个危险因素致呼吸道感染，27.3% 为早产儿，15.9% 出生体重小于 1 500 g。

Walsh 等[5]对门诊病人的检测发现，hMPV 的感染率每年从 2.2% ~ 10.5% 不等，无症状感染约占感染者的 38.8%，住院病人的感染率为每年 4.4% ~ 13.2% 不等，并且 hMPV 感染引起的喘息率要比流感病毒或者合胞病毒感染后表现高。hMPV 的感染症状与合胞病毒感染症状极相似，并且在儿科门诊中，hMPV 的感染率仅次于合胞病毒[6]。

Gerna 等[7]检测了 2004 ~ 2006 年冬春季呼吸道感染患者的鼻咽抽吸物，4.2% 的患者检测有 hMPV 感染，其中成人感染率为 5.76%，儿童的感染率为 1.34%。Pabbaraju的研究小组[8]检测了 2005 ~ 2006 年呼吸道感染患者的鼻咽部样本，其中 hMPV 的感染率是 9.50%，但是在上呼吸道感染者中约占 11.77%，下呼吸道感染中只占 3.64%。说明 hMPV 感染既可以引起上呼吸道感染，也可以引起下呼吸道感染，但是主要是引起上呼道感染，一部分感染者中存在混合感染现象，且这些患者的年龄一般小于 2 周岁。

波士顿 Falsey 等[9]做的一项 ICU 病房研究发现长期应用呼吸支持的 157 名患者的 208 份血清中，hMPV 抗体的检出率是 12.8%，是最常见的两种感染病毒之一。

随着对 hMPV 认识的加深，使得人们逐渐关注 hMPV 在各地区各人群的感染情况，根据现在已发表的数据显示，各地区，或各时间段 hMPV 的感染率差异很大。对 hMPV 感染的危险因素，各时间段或地区感染率差异这么大的原因，仍须在全球较大范围内作前瞻性研究。

3 hMPV 的临床表现

hMPV 感染可以引起上呼吸道或者下呼吸道感染，呈现比较典型的副黏病毒感染症状，主要表现为咳嗽、咳痰、喘息、气促、流涕以及发热、肌痛、头痛、乏力等全身症状，部分可出现低氧血症，类似 RSV 感染，但是感染症状不特异，单独从症状无法与其他呼吸道病毒感染相区别[10]。与合胞病毒相比，hMPV 感染后，声音嘶哑发生的比例高一些[11]。hMPV 感染在成人中引起流感样疾病，在老人中更多表现为呼吸困难和喘息，有心肺基础性疾病的老年患者发病率更要高出 1 倍[11]，而且身体比较虚弱的患者可以导致严重的疾病，如肺炎、呼吸衰竭等。

人的免疫状态对于 hMPV 的感染也是很重要的，应用免疫抑制的患者，hMPV 可以引起严重的、甚至致死的上呼吸道感染。有报道称，急性淋巴瘤白血病患者若由 hMPV 引起上呼吸道感染，严重的甚至可以使患者死亡[12]。Evashuk 等[13]报道了 1 例 9 个月龄的女孩在肝移植后 8 d，因为偏肺病毒感染，发生呼吸衰竭。

西班牙的García-García等[14]提出 hMPV 是引起哮喘的一个诱因。Williams 等[15]在一项成人哮喘发作的研究中发现，有 7 例患者（7/101）在入院时 hMPV 检测为阳性，而在出院 3 个月后及随访中均未呈阳性，故认为 hMPV 是直接诱发哮喘的生物性因素之一。

在日本和德国各有 1 例 hMPV 感染合并脑炎的报道[16-17]，提示 hMPV 可能与脑炎相关，但 hMPV 会不会像其他病毒一样引起中枢感染，这需要在脑脊液标本中进一步检查。

hMPV 感染胸片检查发现异常占 39% ~ 84%，一般为两肺的渗出、浸润和过度充气表现[18-19]。

综上所述，hMPV 主要引起呼吸道感染，但是在一些情况下也可以引起其他系统感染，所以在一些易感人群如老人、儿童、免疫力低下者中要充分考虑 hMPV 感染的可能性。

4 hMPV 感染的免疫反应和致病机制

近来一些研究显示，虽然 hMPV 与合胞病毒感染后临床表现有很高的相似性，但是其致病机制是不同的，hMPV 诱导炎症因子释放的作用很弱。

hMPV 与其他的副黏病毒不同，其进入细胞、感染细胞主要是通过胞吞作用，抑制细胞的胞吞作用以后，hMPV 的感染率下降 90%，并且 hMPV 的感染依赖于低 pH 环境，在应用药物升高细胞内小泡的 pH 值后，病毒感染率可以下降30% ~ 50%，F 基因融合蛋白对于病毒感染细胞有重要的介导调节作用，F 蛋白是在低 pH 的状态下促进细胞与细胞的融合，且外功能区的组氨酸残基对于 F 蛋白的功能有很大影响，将组氨酸残基突变后，降低了其促进细胞融合的作用[20]。另有研究显示 MPRSS2 （一种跨膜丝氨酸蛋白酶）在人肺的上皮细胞中有表达，可以有效的促进感染细胞对 F 蛋白分解，为偏肺病毒的感染、复制提供了有力条件[21]。

现在对于是否有 hMPV 在人体中定植还不清楚，但有试验显示BALB/c 小鼠感染 60 d 后在肺中还持续有人 hMPV，虽然已经产生中和抗体，但 hMPV 基因仍然可以在感染 180 d 以后应用 RT-PCR 的方法检测到，即虽然伴随着逐渐减弱的免疫反应，但是病毒感染持续存在[22]。对于模型小鼠的研究其内源性和适应性免疫反应显示初次感染 hMPV 可以激发较弱的内源性和不正常的适应性免疫反应。这些反应的特点是：Th2 细胞因子在炎症反应的后期诱导生成同时伴有 IL-10 的表达增加和肺部的持续病毒复制。对于 hMPV 感染患者细胞毒性 T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）和抗体的监测发现有延迟反应，但是被动的给予 hMPV 抗体可能有保护作用。与 RSV 感染 BALB/C 小鼠相比，hMPV 感染的特点是：病毒感染需时长、机体的免疫反应复杂[23]。有研究表明[22]用中和抗体衰减感染 hMPV 的 BALB/C 小鼠 T 细胞或 DX5+ 细胞后，可以使其病毒颗粒在肺的滴度增高，这些结果提示细胞毒型细胞可以控制病毒的复制并且可能与人 hMPV 的持续感染有关。

偏肺病毒感染时 G 蛋白可以调节宿主的先天免疫反应，实验结果证实[24]，G 蛋白在调解感染宿主细胞炎症因子的产生中有重要作用，其可以通过影响NF-kB 和干扰素调节因子（interferon regulatory factor，IRF）活性，进而调节 IFN 的产生。把 hMPV 的 N 基因应用 RNA 干扰技术抑制后，可以明显地抑制 hMPV 的增殖，与抑制 F 基因相比，对 N 基因进行干扰后，病毒的 G 和 F 基因表达量也下降明显，提示 N 基因对于病毒的复制比较重要[25]。

虽然现在对于 hMPV 感染后的免疫反应有了一定的认识，但是对病毒在呼吸道上皮细胞是如何引起的细胞信号转导还不是很清楚，Liao 等[26]研究显示人偏肺病毒感染时，可能通过激活气管上皮细胞的维甲酸诱导基因-1—线粒体抗病毒信号（retinoic acid inducible gene-I- mitochondrial antiviral signaling protein，RIG-I-MAVS）蛋白通路，引起先天性免疫反应中的抗病毒和促炎反应因子。

虽然我们已经对 hMPV 的致病机制以及所引起的免疫反应开展了一些研究，但是还有待进一步的阐明，另外对于病毒感染过程中的信号转导，即感染的机制了解得极少，所以在今后应该加强这方面研究，只有这样，才能对易感病人的预防提供有利的理论依据。

5 hMPV 的检测

通过对儿童和成人的血清抗体阳性研究显示 hMPV 不是一个新出现的病毒，而是一个新被认识的可以引起儿童、老人以及免疫抑制患者的上、下呼吸道严重疾病的致病因子。hMPV 的病毒分离比较困难，这也是这种病毒直到 2001 年才被发现的原因。

因 hMPV 生长缓慢且有选择性，轻微致细胞病变作用以及缺乏特异性的诊断试剂，使得病毒的细胞培养很困难。hMPV 可以从急性呼吸道感染患者的鼻咽抽吸物、鼻和咽拭子、气管内吸取物、支气管肺泡灌洗液和其他非特异性呼吸道标本中分离出来。样品取得后放于冰上运输，然后马上接种于单层细胞，37 ℃孵育培养，样品不能冻存或者保存[27]。首次报道 hMPV 的Hoogen等[2]阐明，该病毒可导致猴肾细胞形成合胞，随后发生快速细胞裂解，继之单层细胞脱落。Reina 等[28]把从儿科得到的标本同时接种到各细胞系中，发现 hMPV 可以在 LLC-MK2 细胞系 100% 生长，在 Hep-2 细胞系可以达到 68.7% 生长，在 Vero 中生长率是 28.1%，在 MDCK 的生长率是 3.1%，在 MRC-5 细胞中不生长，一些病毒株在接种后第 3 天可以分离病毒，但是大多数都需要在第 5 天才可以分离。所以通过综合比较 LLC-MK2 细胞是从临床样品中分离 hMPV 的合适细胞株，并且接种后的培养时间一般需要 5 d。

Peret 等[29]实验发现，用 RT-PCR 可以提高培养物中分离物的 hMPV 的检出率。Kaida 等[30]比较了不同类型 PCR 在检测临床样本中 hMPV 的效率，发现在常规 RT-PCR，real-time PCR 以及巢式 PCR 中，它们对于样本的检出率分别是：巢式 PCR 大于 real-time PCR 大于常规 RT-PCR。系统分析后显示 real-time PCR 可以检测出全部四种亚型的人偏肺病毒，所以，real-time PCR 在检测临床标本中的 hMPV 中是一个好的方法。

Kukavica-Ibrulj 和Boivin[31]应用酶联免疫的方法检测冻存鼻咽抽吸物中 hMPV，显示这种方法与 RT-PCR 和病毒培养相比，敏感性是 81%，特异性是 100%，阳性预测值是 100%，阴性预测值是 77%，所以酶联免疫的方法对于检测 hMPV 有很高的特异性，并且比病毒培养方便、快捷。

Landry 等[32]比较了应用 PCR 与商用单克隆抗细胞涂片免疫荧光两种方法对hMPV 的检测，在 202 例病人标本中，应用 RT-PCR 检测到 48 例阳性的标本，应用直接荧光的方法检测到 41 个阳性标本，占 RT-PCR 阳性标本的 85.4%，Aslanzadeh 等[33]和Jun 等[34]的研究结果同样显示，直接荧光的方法在临床标本检测中有很好的特异性。

综上所述，hMPV 可以通过 LLC-MK2 细胞培养获得，但比较困难；应用单克隆抗体直接免疫荧光可以用来检测临床患者的标本，但是与 PCR 相比，其特异性还有待进一步改善。

6 预防与治疗

hMPV 疫苗也正在研制中，Yim 等[35]应用甲醛灭活疫苗免疫棉鼠后，显示疫苗免疫的动物虽然可以保护肺抑制 hMPV 的复制，但是却加重了病理上的损害，特别是间质性肺炎和肺泡性炎抗体滴度提高。Skiadopoulos 等[36]评价了 F、G 和 SH 三种表面糖蛋白的免疫源性，结果提示 F 蛋白具有很高的免疫原性和很高的保护作用，而 G 和 SH 蛋白的免疫原性、保护作用则比较小，所以 F 蛋白是很好的hMPV 疫苗选择蛋白，并且另有不同的实验者[37-38]研究显示应用 F 蛋白免疫动物产生抗体以后，可以使动物对同源或异源性的 hMPV 产生有效的免疫保护作用。有研究者应用基因重组技术使 hMPV 缺少 M2-2或 G 基因后，病毒力降低，并且在非洲绿猴身上可以产生相应免疫反应，提示有可能作为疫苗的筛选方案[39]。Herfst 等[40]应用冷温度传代的合胞或人偏肺病毒感染地鼠以后，检测发现冷温度传代后的人偏肺病毒，再感染动物可以检测到高滴度的抗体，上调免疫，并且可以完全保护其免受变异的人偏肺病毒感染，上呼吸道病毒的滴度下降了 10 000 倍。

随着对 hMPV 认识的加深，hMPV 疫苗研究已经取得了一些进展，但是离疫苗的临床应用还有很大距离。

除了流感病毒以外，其他呼吸道病毒现在都没有太多的治疗或预防方法。对 hMPV 感染的药物治疗进行研究，显示利巴韦林在治疗 hMPV 感染中的作用与治疗 RSV 感染的作用相似[41]，在体外试验中，硫酸唾液酸酯（NMSO3）有抗 hMPV 作用[42]。总之，现在仍然缺乏针对 hMPV 感染的特效治疗手段。

7 结语

2001 年 hMPV 被鉴定分离后，引起全世界临床和科研工作者的关注，虽然近几年对于 hMPV 的流行病学特点有了更详细的认识，但是对其致病机制、疫苗研制和药物预防、治疗方面了解还比较少，有待进一步研究。

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全军“十一五”科研攻关课题（06G026）

陈杭薇，Email：chw.99099@263.net

2009-09-21

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.009