结核分枝杆菌km基因的突变情况分析

王金河,孙海林,李洪敏,梁建琴,冯士生

(1.解放军309医院结研所结核二科,北京100091;2.鄂尔多斯二院结核科)

当前,在治疗MDR-TB的抗结核一线药物大部分已经耐药[1-4],人们开始把目光转向二线药物的应用。其中,使用比较多的药物是卡那霉素(KM)。现在常规药物敏感试验发现,临床亦出现 KM耐药的现象。传统的结核菌药敏试验能初步反映结核分枝杆菌耐KM的表面现象,但不能分析结核分枝杆菌是否发生本质(km基因突变)的变化。本文运用分子生物学方法,分析248株结核分枝杆菌临床分离株的药敏和km基因突变情况,研究KM耐药水平和km基因之间的关系,寻找其内在的联系。

1 材料与方法

1.1 菌种和菌株来源 结核分枝杆菌标准株来源于中国药品生物制品检定所;248株结核分枝杆菌临床分离株来源于本院2006-2007结核科住院病人临床标本。

1.2 分枝杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验 按“结核病诊断细菌学检验规程”进行分枝杆菌BACTEC培养、菌种鉴定和药敏试验。耐卡那霉素药物浓度标准:100μg/ml、10μg/ml和 1μg/ml分别为高度、中、低度耐药[5-7]。

1.3 细菌DNA的制备 采用本室自制的标本前处理试剂盒提取DNA,即:取标本0.5～1 ml,加入等体积的1X Tris.Hcl-EDTA液,加入消化液50μl,混均至80℃水水浴30分钟,每5分钟混均1次,8 000 rpm 10分钟,取上清1 ml。向样本内加入1 ml平衡酚,颠倒混匀数次,勿振荡,8 000 rpm 10分钟,取上层水相加入1ml酚/氯仿(1∶1)颠倒混匀数次,勿振荡,8 000 rpm 10分钟,重复操作一次。取上层水相加入1/10体积的醋酸钠和等体积的无水乙醇,颠倒混匀,-20℃冷却2小时。

随后放置在4℃12 000 rpm离心10分钟,弃上清,加等体积的70%乙醇颠倒混匀,放置在4℃12 000 rpm离心10分钟,弃上清,将水控干,加50μl TE液,保存在4℃冰箱内,准备下一步的实验。

1.4 PCR扩增 在25μl反应体系中,4种dNTP的终浓度各为0.2mmol/L,引物1、2的终浓度各为0.4 μmol/L,纯化的DNA模板10-100 ng,Taq DNA聚合酶1U。置DNA热循环仪扩增后,在2%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增产物。

1.5 PCR—SSCP初步菌种鉴定 结核分枝杆菌16S rDNA 124—275位核苷酸(按大肠杆菌16S rDNA的编码位置)是原核生物高度变异的区域,扩增该区域272 bp片段,在8%(29∶1)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,由于不同种细菌DNA单链的空间构象不同,电泳后片段的迁移率也就不同,而呈现出不同的电泳图谱。与结核分枝杆菌标准图谱相似的分离株判定为结核分枝杆菌复合群;与其图谱不同的分离株判定为非结核分枝杆菌。

1.6 PCR—SSCP分析km基因 根据结核分枝杆菌km基因序列引物1和引物2可扩增360 bp片段。均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增产物在6%(59;1)。非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,银染色后观察结果并照相。以结核分枝杆菌标准株做对照,与结核分枝杆菌标准株单链DNA迁移率相同的为野生型,出现泳动变位的为突变型。

1.7 PCR—DS分析 设计、合成结核分支杆菌km引物k3、4的外部引物 k1、2,可扩增 km基因产生360 bp片段,以k4为测序引物分析k1、2的扩增片段。采用Promega公司生产的fmol DNA测序试剂盒,P—dATP购自北京亚辉生物工程公司,测序电泳后,放射自显影12小时至2天,肉眼识读结果。疑是突变的结核分支杆菌分离株由上海生物技术有限责任公司进一步测序证实。

2 结果

2.1 临床分离株药敏试验结果 248株分枝杆菌分离株经传统药敏试验结果显示,药物敏感株167株,耐卡那霉素分离株81株,耐药率为32.7%(81/248)。其中高浓度耐药占31株,中浓度耐药占12株,低浓度耐药占38株。

2.2 PCR—SSCP初步菌种鉴定 248株分枝杆菌分离株经PCR—SSCP菌种鉴定分析,均与结核分枝杆菌标准株的电泳图谱相似,均产生272 bp片段,证明为结核分枝杆菌。

2.3 PCR—SSCP分析km基因 以结核分枝杆菌标准株扩增产物为对照,81株临床耐药分离株的KM扩增产物经SSCP分析发现,57分离株SSCP均泳动正常,24株SSCP出现泳动变位,突变率为29.6%。

其中高度耐药有14株出现泳动变位,突变率为58.3%(14/24);中度耐药有4株出现泳动变位,突变率为22.2%(4/24);高浓度和中度突变差异显著,P≤0.05。低浓度耐药突变率为16.7%(4/24),同时,经PCR—DS测序分析,均为 km突变株,主要在341位密码子突变,剩余6株单纯低浓度耐药无km基因突变。

3 讨论

抗微生物新药不断涌现,给感染性疾病的治疗带来福音。然而,由于抗微生物药物的广泛应用或不恰当使用,感染性疾病的病原体种类、致病性和对抗生素的敏感性发生的变化,使经验性抗微生物药物的治疗难以奏效。因此,a.正确掌握各类微生物药物的作用机制和细菌的耐药机制,及时准确地检测细菌的耐药性和给予正确的解释,是临床工作的重要任务。b.随着各种二线药物的大量使用,二线药物也出现耐药的情况。为了将耐药趋势控制在最小范围,WTO将二线药物纳入治疗结核病的范围[8,9]。为防止耐二线药物的结核菌的传播,必须对耐二线药物的耐药基因进行细致、深入的研究,这是当前一个十分重要的课题。

抗菌药物敏感性试验(antimicrobial susceptibility test,AST)意义在于:①可预测抗菌治疗的效果,治疗前做AST。即AST试验结果为“敏感”时,今后治疗可能有效;试验结果为“耐药”时,使用该药物治疗肯定失败;②指导临床医生选择使用抗生素,AST的结果往往在给予病人经验性治疗之后的结果,若结果为“耐药”,即应更换药物;③提供所选择药物的依据;④监测耐药性,分析耐药菌的变迁,掌握耐药菌感染病流行病学,控制和预防耐药菌感染的发生和流行。传统的结核菌药敏试验能初步反映结核分枝杆菌耐KM的表型现象,248株分枝杆菌分离株药敏试验结果显示,耐药率为32.7%(81/248),耐药率明显低于抗结核一线药物(抗结核一线五种药物耐药率均在40%以上)。

国内常用抗结核二线药物的一大类为氨基糖苷类(Aminoglucosides)。抗MDR-TB二线氨基糖苷类主要包括:卡那霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素、依替米星、硫酸依替米星、异帕米星等。卡那霉素(Kanamycin)又是二线氨基糖苷类药物使用最广、时间最久的药物,本文着重研究卡那霉素的耐药基因突变情况。

卡那霉素的作用机制和结核分枝杆菌耐卡那霉素的机制还不十分清楚,结核菌耐二线氨基糖苷类药物的作用机制是通过km基因实现的。卡那霉素是一种氨基糖苷类,其主要作用是影响细菌蛋白质的合成,包括(1)抑制细菌蛋白质合成的始动阶段70S始动复合物的形成;(2)能使密码mRNA与不配对的aa-tRNA结合,出现大量错配,形成无用蛋白质;(3)还可以抑制肽链从终止密码上脱落,以便杀灭细菌;(4)亦有人认为细菌蛋白质合成被抑制的同时,细胞膜的蛋白质合成也被抑制,使药物更易进入胞浆,造成恶性循环,细菌胞内必须成分外逸,是造成细菌死亡的又一原因。因此,卡那霉素是治疗MDR-TB方案中有效的常用药物之一。因其抑制细菌蛋白质合成作用广泛,与其它一线抗结核药物相比,耐药率最低(32.7%),其中km基因(尤其是341位密码子)突变是耐卡那霉素产生的主要原因。

结核分枝杆菌km基因突变使菌体蛋白质合成结构改变,卡那霉素药物不能影响菌蛋白质的相互作用,而导致耐卡那霉素菌的产生。km基因突变与卡那霉素耐药水平有一定关系,km基因突变的分离株卡那霉素药物M ICs通常为100μg/ml-10μg/ml之间,M IC在 ≥100μg/ml的分离株突变率为55.5%,M IC在 ≥10μg/ml的分离株突变率为22.2%,1μg/ml亦可见km基因突变,说明km基因突变区域范围广泛,且km基因突变主要在高浓度范围发生。

本文通过PCR—SSCP技术分析了81株结核分枝杆菌耐卡那霉素分离株的km基因,突变率为29.6%,本文约70.4%耐药分离株无基因突变,可能是部分中、低浓度耐药菌还没有到达基因突变的程度;也可能是PCR-SSCP技术本身的局限性未能检测出所有的突变,或由于km基因其它部位突变或由其它耐药基因突变所致,或存在其它耐药机制。

目前,在我国临床应用卡那霉素药物比较广泛,从本文分析中得知该药是一种比较稳定的药物,其杀菌作用广泛,在短期治疗结核病的过程中,不易引起结核菌的耐药。即使耐药,km基因突变区域也主要在高浓度范围。然而,临床还应根据耐药水平和耐药基因分析情况,进行有针对性的治疗,这样才能使MDR-TB病治疗有效。

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