RUNX3基因及其与肝癌的相关性研究

卢燕辉， 李建国

RUNX3基因为一种新近发现的肿瘤抑制基因，广泛表达于消化道上皮细胞、间叶细胞、血液细胞及神经细胞等。其与胃癌、乳癌、大肠癌的相关性研究较多，本文就RUNX3基因与肝癌的相关性研究作一综述。

1 关于RUNX3基因

1.1 RUNX3基因的定义 人RUNT相关转录因子3(human runt-related transcription factor 3，RUNX3)早在1994年被Levanon等发现，先后被命名为急性髓性白血病2基因、多瘤病毒强化因子结合蛋白2基因、核心结合因子α3基因。作为RUNT家族成员，他参与胚胎发育过程中细胞基因表达调控，并且是RUNT家族中最小、迄今研究也最少的基因成员，是哺乳动物RUNT家族进化的基础［1］。

1.2 RUNX家族基因产物的功能 在哺乳动物中RUNX基因家族由 3个成员组成，即 RUNX1、RUNX2和RUNX3，各有不同的生物学功能。30%的人类急性白血病伴RUNX1基因的改变，人类锁骨、颅骨发育不良等骨疾病与 RUNX2的突变有关［2-3］，脊神经节的神经发育及胃黏膜上皮细胞的增生异常与RUNX3的表达缺失或下降相关［4-5］。

1.3 RUNX3基因的定位与结构特点 RUNX3基因位于人类1号染色体的1p36和鼠4号染色体上，人类RUNX3蛋白由415个氨基酸残基构成，是由α和β亚单位构成的异二聚体。α亚单位含有128个氨基酸残基组成的RUN结构域(RUNT Domain，RD)，RD位于RUNX的氨基末端，介导RUNX蛋白与DNA结合和与蛋白的相互作用。α亚单位介导RD与靶DNA特殊基因序列的结合，β亚单位能增强RD与靶DNA的结合力［6-7］。RUNX3基因全长约67kb，含有P1和P2两个启动子，6个外显子和1 290 bp的开放阅读框，内含子1跨越了整条基因全长的一半(35 Kb)。RUNX3基因含有2个大的高度保守的CpG岛，一个位于外显子2附近，另一个位于外显子6起始部分。两个启动子富含GC，都没有TATA盒而有CCAAT盒，两个启动子区域含数个分离的转录起始点，RUNX3 mRNA主要来自于P2启动子的转录，P2启动子GC含量(64%)高于P1启动子［1］。

1.4 RUNX3在免疫系统发育中的作用 Woolf等［8］发现RUNX3高表达于胸腺髓质。RUNX3基因敲除小鼠胸腺细胞谱系后CD4表达异常，CD8+T细胞成熟障碍;小鼠外周血CD8+T细胞表达CD4，增殖能力下降;小鼠的细胞毒性淋巴细胞和同种异体免疫的腹腔灌洗T细胞的数量都显著下降。由此认为 RUNX3与 RUNX1一起参与了小鼠胸腺CD8+T淋巴细胞的分化，都是CD4基因的转录抑制因子。研究显示RUNX3在转化生长因子 β(transforming growth factorbeta，TGF-β)诱导的 B 细胞IgA亚型的转换中起重要作用。TGFβ可以诱导小鼠脾脏B细胞和IgM+B细胞胚系Igα基因的转录，导致B细胞IgA亚类的转换。

1.5 RUNX3与细胞的生长、凋亡、分化 动物实验中发现RUNX3－/－的小鼠胃黏膜细胞增殖速度加快，对TGF-β的抑制生长没有反应，相对观察的正常小鼠的胃黏膜细胞的增殖能显著的被TGF-β抑制［9］，说明RUNX3是通过 TGF-β 通路来调节胃黏膜细胞生长凋亡的。Li等［10］最近研究RUNX3的肿瘤抑制作用发现，肿瘤细胞对裸鼠的致癌作用与RUNX3的表达呈负相关，进一步研究发现，来源于p53/-小鼠腺胃的RUNX3－/－正常上皮细胞可在裸鼠体内诱导形成肿瘤，而RUNX3+/+上皮细胞则不能。为了检测RUNX3对胃黏膜细胞分化的调控，分别取 RUNX3－/－p53－/－和 RUNX3+/+p53－/－小鼠胃黏膜细胞进行细胞培养，发现RUNX3+/+p53－/－的胃黏膜有含有腺体结构的柱状细胞，细胞排列极性好，和正常的胃黏膜细胞相似，而相对的RUNX3－/－p53－/－细胞之间缺少连接，没有发现腺体结构，细胞排列没有极性，这些现象说明RUNX3缺失时胃黏膜细胞即处于低分化状态，证明RUNX3具有调节胃黏膜细胞的正常分化的功能。这些都说明RUNX3是通过使TGF-β介导凋亡通路中的一些凋亡因子激活来介导胃黏膜细胞正常凋亡活动的，当RUNX3失活后，正常凋亡受到抑制，胃黏膜细胞的增殖和凋亡间动态平衡被打乱，遗传学上不稳定的细胞便可克隆扩增而发生胃癌。

1.6 RUNX3抑制胃癌细胞侵袭转移的能力 TIMP-1是MMP9主要的内源抑制因子，进一步RTPCR、Western blot及ELISA的结果证实，RUNX3能上调TIMP-1在mRNA和蛋白水平的表达以及胃癌细胞培养上清中TIMP-1的水平，因此RUNX3可通过上调TIMP-1的表达水平，从而抑制MMP9的酶活性;ELISA还发现RUNX3可以抑制胃癌细胞培养上清中VEGF的表达水平，提示 RUNX3通过抑制VEGF的表达来减少胃癌的血管生成。经过Trizol法抽提SGC7901/pBK-RUNX3和空载体转染的对照细胞SGC7901/pBK-CMV的总RNA，再通过琼脂糖电泳检查及紫外定量分析表明所提取得RNA无明显降解，其质和量均符合芯片检测要求。经荧光探针的制备、纯化及定量，芯片杂交、图像采集和数据分析等步骤得到差异表达的基因。以两种细胞信号强度的比值小于0.5或者大于2作为判定标准，结果发现，与对照细胞相比，RUNX3表达上调后，SGC7901/pBK-RUNX3细胞中有14个基因表达被上调，109个基因表达被下调［11］。在基因芯片筛选出的下游基因中，通过RT-PCR对个别差异表达的基因进行验证，证实接头分子CRKⅡ的表达在胃癌细胞 MKN28和 SGC7901中可被 RUNX3抑制。RUNX3作为转录因子增强TIMP-1在转录水平的表达，双荧光素酶报告基因实验结果显示，pBKRUNX3质粒与pGL-TIMP-1共转染MKN28细胞后，细胞内的激发荧光强度显著高于质粒与pBK-CMV空载体转染的MKN28细胞，表明RUNX3可以增强TIMP-1。启动子的活性实验发现，设计扩增包含TIMP-1启动子上2个RUNX3结合位点的序列的特异性引物，经RUNX3抗体沉淀后的DNA模版可以扩增出特异性的片段，提示无论是内源性表达的RUNX3还是外源性的 RUNX3均可在细胞内与TIMP-1的启动子结合并相互作用。进一步EMSA和Supper Shift试验结果显示:SGC7901细胞核蛋白提取物可以使TIMP-1启动子的双链DNA探针的电泳条带滞后，而RUNX3抗体可以使电泳条带进一步滞后。表明RUNX3可以与TIMP-1启动子上的两个保守结合位点结合［12］。

1.7 RUNX3的抑癌机制 RUNX3基因是 TGF-β信号转导通路下游的一个转录因子，TGF-β是许多细胞生长的有效抑制因子，TGF-β信号转导通路的紊乱可导致多种肿瘤的发生［11］。TGF-β信号在细胞内的转导主要由Smad蛋白介导，而RUNX基因的每种形式均可与R-Smad(Smad2、Smad3)结合而对TGF-β的信号转导产生重要影响。Zaidi等［13］的研究表明，在 TGF-β信号转导过程中，被激活的Smad复合物需要在RUNX基因(包括RUNX3)的指导下，才能从胞质转入核内特定靶位点，与RUNX基因共同激活靶基因的转录，从而对细胞的分化、周期调控、凋亡和恶性转化起作用。早前Li等［10］也发现，剔除RUNX3基因的小鼠表现为胃黏膜异常增生，并对TGF-β所诱导的上皮细胞生长抑制和凋亡作用缺乏反应。这些研究均提示RUNX3基因可能作为TGF-β转导通路中的一个重要环节，参与TGF-β对上皮细胞生长的负性调控作用。

2 RUNX3基因表达降低或缺失的机制

2.1 RUNX3突变与表达 突变是肿瘤抑制基因失活的主要机制之一。Li等［10］采用PCR-SSCP方法检测119例胃癌组织中RUNX3表达下调是否与RUNX3基因编码区域突变有关，结果发现仅1例(1/119)胃癌组织存在RUNX3突变，其突变位点位于RUNX保守区C373 C-T的转换，使第122位点精氨酸转变成半胱氨酸(R122C)。然而，实验未能检测配对的正常胃黏膜组织，因此尚不能确定该结果是否属于真正的突变。为了进一步证实R122C突变的意义，Guo等［14］分别将野生型和突变型RUNX3基因(R122C)转染至胃癌细胞株MKN74(RUNX3－/－)，观察细胞的生长曲线，结果发现RUNX3野生型组可以明显抑制细胞生长，而突变与空载体组生长曲线相似，提示突变型RUNX3(Rl22C)的活性降低/失活，不能抑制 MKN74细胞的生长。Wei等［15］近来对6株胃癌细胞系RUNX3基因编码区域进行检测，未发现点突变发生，认为突变不是RUNX3基因表达降低或缺失的主要机制。可见，RUNX3基因突变与胃癌的关系尚不清楚，有待于进一步研究。

2.2 RUNX3甲基化与表达 DNA甲基化是表观遗传修饰的一个重要方式，DNA的甲基化状态受到DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的调节，该酶能使CpG岛的胞嘧啶环5'位的氢被s-腺苷甲硫氨酸的活性甲基所取代，变成5'-甲基胞嘧啶［16］。DNA甲基化主要发生在富含CpG岛的启动子区域，通过该区域的甲基化将直接阻碍转录因子如AP-2、c-Myc/Myn、CREB、E2F 等与启动子结合，从而使基因不能转录或转录水平降低启动子区CpG岛的甲基化是肿瘤抑制基因失活的另一主要机制RUNX3启动子P2区域有一个典型CPG岛。近年来，有关人类各种肿瘤细胞系或肿瘤组织中RUNX3表达下调的研究也渐有报道，而RUNX3启动子区域CpG岛的甲基化是导致RUNX3表达下调的主要原因之一，其中包括肺癌(7/16，43.8%)、膀胱癌(90/124，73%)、肝癌(30/73，41.1%)和结肠癌(19/91，21%)等［17-18］。Li等［10］用甲基化敏感酶和不敏感酶从15个胃癌细胞系中消化分离出基因组DNA，检测RUNX3启动子P2区域CpG岛的甲基化状态，结果显示RUNX3低表达或失表达与RUNX3启动子附近区域甲基化有关。研究者采用甲基化特异性PCR方法(MR)检测了6株具有代表性的胃癌细胞系(其中3株表达 RUNX3，3株无 RUNX3表达)及3例胃癌组织和配对的正常胃黏膜组织中的DNA甲基化状态，结果3株RUNX3失表达的细胞系(SNU1，MKN28，MKN74)中RUNX3外显子1区的CpG二核苷酸序列的C残基完全甲基化，而表达RUNX3的3株细胞系(MKN1，RF1，RF48)则在该区域不存在甲基化;同样3例胃癌组织中RUNX3全部失表达，他们的RUNX3外显子1区的CpG二核苷酸序列的C残基也完全甲基化，而3例正常胃黏膜组织均表达RUNX3，在相应区域未检测到甲基化。Waki等［19］检测了10株胃癌细胞系、93例胃癌组织及相应正常胃黏膜组织RUNX3基因启动子甲基化状态，结果7株(7/10，70%)胃癌细胞系、42例(42/93，45%)胃癌组织和7例(7/93，8%)正常胃黏膜组织存在甲基化。Kim等［20］对75例胃癌、48例肝癌、37例喉癌、24例肺癌、25例乳腺癌、44例前列腺癌、24例子宫内膜癌、61例结肠癌、40例宫颈癌和各种胃癌前期病变组织(胃腺瘤77例、慢性胃炎伴肠上皮化生32例和慢性胃炎不伴肠上皮化生99例)RUNX3甲基化状态进行检测，发现多数前肠器官来源的肿瘤组织存在RUNX3甲基化，在胃癌组织中RUNX3甲基化发生率为64%，而在各种胃癌前期病变组织中也存在不同程度的RUNX3甲基化，其中胃腺瘤27.3%，慢性胃炎伴肠上皮化生28.1% 和慢性胃炎不伴肠上皮化生8.1%。因此认为RUNX3甲基化发生随癌前期病变向癌的方向发展而增加，RUNX3甲基化检测有望成为多种癌诊断的生物标记物。近来，Homma等［21］对RUNX3基因甲基化异常机制与胃癌的关系做了更进一步的研究发现大多数胃癌细胞系(9/10，90%)、胃癌组织(43/45，96%)和配对的正常胃黏膜组织(43/45，96%)均存在RUNX3基因5'端CpG岛的甲基化，而在被视为导致基因沉默的关键部位——转录起始点附近区域的甲基化发生率较低，分别为40%(4/10)、53%(24/45)和 11%(5/45)，因此认为，RUNX3基因高甲基化起初发生在5＇端CpG岛，进而向转录起始点区域扩展，最终导致RUNX3 mRNA失表达，RUNX3基因CpG岛多区域甲基化状态检测对胃癌的诊断及风险评估具有重要意义。

3 国内外RUNX3基因在肝癌方面的研究现状

Mori等［22］分析了5种肝癌细胞系和41例肝细胞癌组织中RUNX3的遗传学以及表遗传学信息，结果在80.0%(4/5)的癌细胞系和75.6%(31/41)的肝癌患者中检测到RUNX3启动子区的高甲基化，在 37.8%的患者中检测到 RUNX3的 LOH。Park等［23］专门研究了肝癌中RUNX3的甲基化状态及其与重要临床病理参数之间的联系，发现40.0%(4/10)的癌细胞系和41.1%(30/73)的肝癌患者中都存在RUNX3的甲基化，并与组织学分级、微血管浸润和临床分期密切相关，甚至认为RUNX3的甲基化是发生在肝癌形成早期的重要事件。Xiao等［24］对肝细胞癌RUNX3基因在肝细胞癌的发生、发展过程中的作用进行初步研究，他们用3个SNP作为RUNX3基因的标志，检测RUNX3基因的等位缺失，发现30.6%(11/36)的信息个体存在等位缺失，54.4%(49/90)的肝细胞癌为高甲基化状态，而对应的正常肝组织未发现高甲基化现象。实验发现11例存在等位缺失的肝细胞癌同时有9例存在高甲基化状态，即在肝细胞癌组中有81.5%的病例RUNX3基因同时高甲基化和等位缺失而完全失活。其结果与先前报道的肝细胞癌在IP36位点存在30.0%左右的等位缺失结果基本一致。实验表明高甲基化和等位缺失共同促进了肝细胞癌RUNX3基因的失活，此结果还提示肝细胞癌TGF-β信号传导障碍可能与RUNX3基因失活有关。随着甲基化研究技术的进步，发现越来越多的基因甲基化状态与肝癌的发生有关，多数研究是通过比较肝癌与癌旁及正常组织之间基因甲基化状态差异，来确定目的基因与HCC发生的相关程度。肖文华等［25］发现，30.6%(11/36)的肝癌患者存在RUNX3的 LOH，54.4%(49/90)的患者存在RUNX3的高甲基化，且11例存在LOH的肝癌中有9例存在高甲基化，而在所有患者中均未发现 RUNX3突变，同时发现RUNX3的LOH与门静脉癌栓、肝内转移和微血管受侵有关。在RUNX3基因与肝癌发生发展关系的研究中目前国内还未见从蛋白水平进行相关研究的报道。

4 RUNX3基因的测定方法

目前，可从DNA、RNA、蛋白三个水平对RUNX3基因的表达情况进行检测及分析。DNA的检测多检测其DNA的甲基化率，在这方面目前采用最多也最值得肯定的是甲基化特异性聚合酶链反应即MSP-PCR，之前必须先对组织标本进行DNA的抽提，然后进行凝胶电泳并在凝胶成像分析系统中通过条带的显示进行DNA甲基化率的分析;RNA的检测多采用逆转录聚合酶链反应即 RT-PCR，与MSP-PCR相同的是必须进行RNA的抽提，不同的是RNA的抽提容易被很多因素干扰而失败，比如实验环境与操作过程的不合格。目前Trizol抽提法应用较为普遍，优点是抽提的RNA量较多，缺点是受人为因素的干扰较大，而试剂盒抽提法刚好相反(RNA量较少，受人为因素的干扰较小)，抽提的RNA既可以凝胶电泳并在凝胶成像分析系统中通过条带的显示进行RNA分析也可以用分光光度计进行RNA的精确定量，然后用浓度和纯度符合要求的RNA进行RT-PCR来检测分析RNA的表达情况;近年来引进了一项很先进的PCR技术即实时荧光定量技术，即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与RT-PCR方法相比，主要有以下特点:(1)实验所检测的Ct值，正处于PCR循环的指数扩增期(对数期)，即线性期的起始阶段，最接近真实模板量，此时微小误差尚小，保证Ct值的重现性［26］，而半定量PCR只能检测到肉眼观察的扩增循环数，此时有平台效应而造成误差，且属终点检测，未能实时动态观察变化趋势;(2)荧光定量PCR应用特异性引物和特异性探针，尽可能避免了常规PCR的非特异性扩增;(3)整个过程处于密闭状态，减少了样品后期处理造成的潜在实验室污染可能;(4)荧光定量PCR以目的基因PCR产物构建标准曲线，能够从定量水平上精确计算出待测标本中目的基因的起始数量。以上特点保证了实时荧光定量PCR技术进行定量检测时的可重复性、准确性和特异性［27］。蛋白的检测可采用免疫组化和Western blot;前者可不用进行蛋白的抽提而直接在显微镜下通过细胞核或核与胞浆的染色来评价阳性率进而分析蛋白的表达情况，不足之处是不能对蛋白进行精确定量检测且其需要一定的病理学基础;而后者可以对蛋白的表达进行精确定量检测，但之前必须进行蛋白的抽提。

5 结语

RUNX3基因作为一种新近发现的抑癌基因，关于其失活机制、抑癌机制及其与肿瘤关系的研究正在不断深入。目前研究较多的是RUNX3基因与胃癌的关系，但其与肝癌关系的研究还处于萌芽状态，这方面的进一步研究，势必为肝癌的诊断和治疗揭开新的篇章。

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